浙貝母灰霉病菌生防菌的篩選和抑菌活性測定

蔡嘉慧， 羅秀俊， 王明爽， 孟一君， 王慧中

(杭州師范大學 浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 311121)

浙貝母(Fritillariathunbergi)為百合科貝母屬植物，原產地為杭州筧橋[1]，其后移植于鄞縣之象山，又稱象貝母。浙貝母作為名貴中藥材，具有很高的藥用價值，主治傷寒煩熱、咳嗽止氣，安五臟、利骨髓、消痰、潤心肺，兼有消炎退腫、治療癰癤腫毒等功效[2]。隨著種植面積不斷擴大，浙貝母的病害日益嚴重，其中灰霉病[3]為主要病害，浙貝母的葉、莖、花、果實均能受害，以葉片的癥狀最為顯著，嚴重時可導致植株枯死[4]。浙貝母受灰霉病侵染后，不僅會造成產量損失而且會影響浙貝母的藥效品質，進而導致貝母的商品性和銷售價格下降，嚴重影響著浙江貝母產業的健康發展。

灰霉病菌由于寄主范圍廣，作物種質資源中尚未發現抗病品種。目前對灰霉病菌的防治主要采用化學防治。然而，傳統的化學藥劑防治易造成環境污染、農藥殘留、危害健康等一系列問題[5]，長期使用還會導致田間抗藥性灰霉病菌的大量出現[6]，使化學防治效果不斷降低。近年來，隨著人們健康環保意識的不斷增強，對浙貝母等傳統中藥材的品質也越來越重視。因此，探索浙貝母灰霉病高效生物防治技術已成為未來病害防治的一個重要方向。本研究以浙貝母灰霉病菌作為靶標微生物，篩選具有高效拮抗作用的細菌并進行鑒定，檢測其抑菌活性，以期為貝母灰霉病的綠色防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菊花采自桐鄉龍涇村種植區，浙貝母灰霉病菌、黑斑病菌和炭疽病菌為試驗室保存菌株。培養基有肉湯培養基(LB)、馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖水培養基(PDB)、Landy培養基(葡萄糖20 g，L-谷氨酸5 g，酵母粉1 g，KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl分別為1.0、0.5、0.5 g，L-苯丙氨酸、MnSO4、GuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O分別為2×10-3、5×10-3、0.16×10-3、0.15×10-3g)。

1.2 菌種分離

菌種分離采用平板梯度稀釋法，將健康菊花根系土壤放置于無菌三角瓶內，加入50 mL無菌水，靜置10 min得到10-1原液，用移液槍吸取1 mL至裝有9 mL無菌水的試管中，得到10-2稀釋液。按此方法再將原液稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6備用。分別用移液槍吸取100 μL均勻涂布至LB培養基上，每處理重復3次。將涂布好的培養基放置于恒溫培養箱，37 ℃培養24 h。根據菌落形態、顏色、透明度等特征，挑取不同的菌落在LB平板上劃線純化、標記、編號。

1.3 浙貝母灰霉病菌生防菌的篩選

將供式病原菌接種到PDA平皿1.5 cm處，在同一平皿上接種篩選到的純化細菌，每處理重復3次，28 ℃培養3 d后觀察抑菌距離。

1.4 菌株的16SrDNA鑒定

將培養2 d的拮抗菌菌株接種至含1 mL LB液體培養基的EP管(100 mL)中，于37 ℃、220 r·min-1恒溫振蕩培養16 h后制成菌體懸浮液。

采用細菌通用引物27F(5 AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG 3)和1429 R(5 GGTTACCTTGT TACGACTT 3)對提取的DNA進行PCR擴增，擴增反應在40 μL體系進行。擴增中用無菌水代替DNA為空白對照。

PCR程序。95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

用凝膠電泳法檢測PCR反應，吸取5 μL PCR 產物加入1%(m/V，m、V分別代表瓊脂糖質量和緩沖液的體積)瓊脂糖凝膠，凝膠置于1×TAE緩沖液中，120 V電泳30 min。將擴增后的DNA產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化測序，并把測序結果與GenBank中的序列進行Blastn比對，以16S rDNA相似序列，利用MEGAX軟件的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.5 抑菌活性測定

對生防菌抑菌活性的初篩、復篩采用對峙法。初篩出效果明顯的菌株進行復篩，過程如初篩，每處理重復3次。

1.6 抑菌譜測定

采用對峙培養法，同浙貝母灰霉菌生防菌的篩選。測定篩選出的菌株對供試菌浙貝母灰霉病菌、炭疽菌、黑斑病菌的抑菌活性，以無菌水為對照。

1.7 拮抗菌代謝物活性測定

根據王帥等[7]的方法提取拮抗細菌代謝產物。將保存的生防菌種轉接到LB平板上，37 ℃培養12 h，用接種環挑取菌落，接種于含有100 mL液體LB培養基中，于37 ℃、200 r·min-1下恒溫振蕩培養24 h，作為種子液。

采用酸沉淀法[8]提取次生代謝產物。Landy培養基初始pH值為7.0，以接種量3%為條件，將種子液加入含有1 L Landy培養基的三角瓶中，于37 ℃培養38 h，在7 000 r·min-1離心10 min，去菌體細胞，在去細胞液中加入6 mol·L-1HCl，調節pH為4.0，于7 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀，將其于60 ℃的烘箱里干燥，稱重即為次生代謝產物。最后將得到的產物在121 ℃高溫高壓滅菌20 min，得到無菌次生代謝產物。將無水乙醇用0.22 μm過濾膜過濾，得到無菌無水乙醇，以此溶解次生代謝產物，配成400、200、100 μL不同濃度梯度，與15 mL PDA混合，將灰霉菌接種于PDA平板上，觀察菌落生長情況，以無水乙醇為對照。以上試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選和分離

從健康菊花根系土壤分離到50株細菌。以浙貝母灰霉菌為指示菌，篩選出有明顯抑菌作用的拮抗菌株B-2，其抑菌程度如圖1所示。

圖1 B-2對交鏈格孢菌、炭疽病菌、灰霉病菌的抑菌效果

由圖1可知，接有拮抗菌株的交鏈格孢菌、炭疽菌及灰霉菌的菌絲生長受到明顯抑制，即拮抗菌株B-2對交鏈格孢菌、炭疽病菌、灰霉病菌這3種病原真菌均有明顯的抑制作用。由此說明，該拮抗菌株對貝母主要病原真菌具有一定的廣譜抗性，生防作用前景較好。

2.2 拮抗菌株的16S rDNA鑒定

以B-2菌株基因組DNA為模板，用通用引物27F和1492R對16S rDNA序列進行PCR擴增，將獲得的擴增產物進行測序。將該序列通過Blastn程序與GenBank中序列進行對比分析，結果顯示，此菌株與其比對的芽孢桿菌屬同源，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、貝萊斯芽胞桿菌、甲基營養型芽胞桿菌和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株的相似性均超過99.5%。由于序列相似性極高，采用MEGA X軟件，以GenBank中16S rDNA相似序列及B-2菌株的16SrDNA序列構建的系統進化樹暫不能確定該菌株的種。

2.3 拮抗菌次生代謝產物對灰霉菌的效果

由圖2可知，拮抗菌代謝產物對灰霉病具有抑菌作用，且在100 μL時便呈現出較好的抑菌效果，該濃度下灰霉病菌無法向平板擴展，部分菌絲在菌餅上向空中生長。此外，經高溫高壓滅菌后，次級代謝物的抑菌效果與未滅菌代謝物幾乎一致，說明抑菌物質不受溫度影響，較為穩定。因此，該生防菌的代謝產物也具有潛在的應用價值。

圖2 B-2代謝產物對灰霉菌的抑制作用

3 小結

對健康菊花根系土壤細菌進行分離、初篩、復篩，得到1株對浙貝母灰霉菌有明顯拮抗作用的菌株。抑菌試驗表明，該菌株對炭疽菌、交鏈格孢菌、灰霉菌這3種較為廣泛的植物病原菌均具有明顯抑制作用，具備較廣的抑菌能力。通過16S rDNA序列測定，將該菌株鑒定為芽孢桿菌。該菌株的次級代謝產物對灰霉病菌具有較強的抑制作用。

芽孢桿菌屬具有廣泛的抑菌譜，能分泌多種拮抗物質，是目前應用較為廣泛的生防細菌[9]。用于防治植物病害的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及多黏芽孢桿菌等。根據閆楊等[10]的報道，作為一種益生菌，枯草芽孢桿菌在植物病害防治、動物飼料、醫藥生產多方面被廣泛應用。解淀粉芽孢桿菌不同菌株會產生不同的抗菌物質，據報道菌株FZB42對真菌、細菌、線蟲等病害具有抑制活性，解淀粉芽孢桿菌NJN-6[11]、Plantarum UCMB5113[12]、H-2-5[13]都能促進植物的生長。多黏類芽孢桿菌也可有效防治由多種真菌、細菌等引起的病害[14]，如多黏類芽孢桿菌LM-3能通過分泌多肽類物質拮抗稻瘟病[15]。本試驗首次報道了芽孢桿菌對浙貝母灰霉病的抑制作用，為浙貝母病害防治提供了新策略和參考。雖然本研究在實驗室條件下篩選到對浙貝母灰霉病病原菌具有較好效果的生防菌，但其在田間的效果尚未可知，仍需盆栽試驗和大田試驗進行進一步驗證。