觀賞羽衣甘藍紅葉性狀的轉錄組分析

譚晨， 劉慧春， 張加強， 周江華， 朱開元

(浙江省農業科學院 浙江省園林植物與花卉研究所，浙江 杭州 311202)

羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar. acephala，2n=18)是十字花科蕓薹屬2 a生觀葉植物，葉形酷似牡丹，又名“葉牡丹”。羽衣甘藍喜歡冷涼氣候，是能夠應用于冬季花壇的為數不多的園林綠化材料。觀賞羽衣甘藍葉色絢麗，邊緣葉有翠綠色、深綠色、灰綠色、黃綠色，中心葉則有純白、淡黃、肉色、粉紅、玫瑰紅、紫紅等及復色品種[1]。羽衣甘藍葉色方面的研究還較少，相關色素的積累與代謝平衡的分子機制有待深入研究。

近年來，國內外研究者對羽衣甘藍葉色的呈色機理進行了探索研究，主要集中在生理生化測定以及少量的基因定位研究。例如，王雅瓊[1]對不同品種羽衣甘藍生長期的葉綠素、類胡蘿卜素和花青素等色素含量變化進行了系統的研究，從生理學角度闡述了觀賞羽衣甘藍內葉呈現紫色和黃色是葉綠素降解、花青素積累、類胡蘿卜素含量下降的幅度較葉綠素低造成的。Zhang等[2]通過基因表達研究，推測一個花青素代謝途徑中MYB轉錄調控因子BoPAP1在低溫誘導羽衣甘藍花青素合成和積累過程中發揮重要作用。Liu等[3]通過構建F2分離群體，發現羽衣甘藍紫色性狀是由一對顯性基因控制的，將紫葉基因BoPr精細定位到了C09染色體上280 kb的區間，并確認候選基因為Bo9g058630(DFR基因)，是一個花青素苷合成途徑中的基因。Ren等[4]也通過F2分離群體將紅葉基因Re定位在1.8 cM區間，候選基因也是DFR基因。這些研究表明，花青素苷的生物合成與積累是羽衣甘藍紅/紫葉色形成的關鍵。

花青素苷(anthocyanin)是一種植物體內廣泛存在的水溶性類黃酮化合物，多分布于植物的花、果實、種子、葉等組織器官中，賦予植物紅色、紫色、藍色等不同的色澤[5-6]。植物花青素苷的代謝合成途徑已較為清楚，花青素苷在細胞質中以苯丙氨酸為底物，再經羧基化、糖基化、甲基化、?；揎椇筠D運至液泡。催化這一系列反應的酶類屬于結構基因，包括早期基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′H)和晚期基因(DFR、ANS、UFGT)等，這些基因在不同植物種類中較為保守[5]。花青素苷的合成還需要轉錄因子的調控，其中研究最廣泛、最清楚的主要包括MYB、bHLH和WD40三類轉錄因子。在模式植物擬南芥中，多個調控花青素苷合成的MYB、bHLH和WD40轉錄因子被鑒定出來：第一類MYB轉錄因子包括MYB75、MYB90、MYB113、MYB114、MYB11、MYB12、MYB111等；第二類bHLH轉錄因子包括TT8、GL3、EGL3；第三類WD40轉錄因子為TTGl。大部分花青素苷合成途徑的結構基因如DFR、ANS、UFGT等的轉錄均是由這三類轉錄因子組成的蛋白復合體MYB-bHLH-WD40(MBW)調控[6-9]。比如在擬南芥幼苗和葉中，在花青素苷含量高的材料中參與花青素苷生物合成的R2R3-MYB蛋白PAP1、PAP2、MYB113和MYB114，bHLH蛋白TT8、EGL3和GL3以及WD40蛋白TTG1均上調表達[10]。其他物種中也存在類似的調控機制[6]。

盡管目前已經有了少量羽衣甘藍葉色研究的報道[3,11-13]，但羽衣甘藍的花青素苷合成途徑的關鍵基因及相關分子調控網絡尚不清楚，有待進一步研究。本研究擬通過對羽衣甘藍生長發育的不同時期花青素苷的積累水平進行比較研究，通過RNA-Seq的方法從轉錄水平上揭示羽衣甘藍葉色形成的基因表達差異，篩選出羽衣甘藍花青素苷生物合成與積累的關鍵基因及調控因子，以期在分子水平上解析羽衣甘藍葉色形成及調控的機制，為羽衣甘藍葉色遺傳改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取2種不同葉色的羽衣甘藍品種為研究對象：紅葉品種(內葉紅色、外葉綠色)和白葉品種(內葉白色、外葉綠色)，每個品種30株(設置3個重復，每個重復10株)，在觀賞期(播種后約90 d)隨機選取2個品種各3～5個單株，分別剪取內、外葉片用錫紙包裹后迅速投入液氮中速凍，于-80 ℃冰箱中保存備用，這些材料用于后續生理指標測定和總RNA提取。

1.2 花青素苷含量測定

采用UV分光光度計在536 nm和700 nm下測吸光值，根據pH示差法計算花青素苷總含量。

1.3 高通量測序及數據分析

對2個羽衣甘藍品種材料的內葉和外葉的4個樣品(3個生物學重復/樣)共計12份樣，分別進行轉錄組文庫構建和高通量測序。通過FastQC等分析軟件對原始數據文件進行質量控制，獲得高質量的有效序列(clean reads)。將得到的有效序列通過HISAT2軟件與甘藍參考基因組進行比對，采用Subread軟件獲得基因的表達量數據，歸一化后的表達量數據使用DEGSeq2軟件包對不同材料、不同組織部位的組合進行基因差異表達分析，對差異表達基因進行GO/KEGG注釋。

2 結果與分析

2.1 花青素苷在紅葉材料中大量積累

本研究選取葉色不同的2個觀賞羽衣甘藍材料作為研究對象：紅葉材料(A為紅色內葉，B為綠色外葉)和白葉材料(C為白色內葉，D為綠色外葉)(圖1中a)。各樣品中的總花青素苷含量也明顯不同(圖1中b)，色素含量測定結果顯示，4個樣品中樣品A的總花青素苷含量最高，其次是B和D，而樣品C的含量最低；進一步分析表明紅葉材料中內葉(A)的花青素苷含量比白葉材料內葉(C)高出20倍以上，差異極顯著；此外，紅葉材料外葉(B)的花青素苷含量也顯著高于白葉材料外葉(D)。因此，紅葉材料的花青素苷含量顯著高于白葉材料，也就是說花青素苷的積累是羽衣甘藍紅葉產生的主要原因，這與前人的研究結論一致[1,11-12]。

a—紅葉和白葉材料觀賞期表型，標尺=5 cm；b—各樣品總花青素苷含量，**表示與A樣品比較，P<0.01。圖1 表型及花青素苷含量測定

2.2 轉錄組測序與數據分析

本研究構建了12個轉錄組文庫并在Illumina HiSeq2500平臺上測序，各樣品獲得了41～56百萬個有效序列，一共獲得89.58 Gb的有效測序數據；測序數據的質量分析結果顯示，Q30堿基百分比在92%以上，平均GC含量為46.82%，表明本研究中測序數據質量可靠，為后續分析的準確性提供了保障(表1)。隨后，采用HISAT2軟件將有效序列與甘藍參考基因組進行比對，發現本研究中87%以上的序列能夠比對到甘藍參考基因組上。此外，使用StringTie軟件進行了新轉錄本組裝，并對這些新轉錄本進行了Pfam、SUPERFAMILY、GO、KEGG等數據庫注釋，最終預測了3 067個新基因。比對完成后，采用Subread軟件對基因進行了表達水平的定量，獲得了基因的表達水平數據用于后續分析。

表1 測序數據情況

2.3 差異基因表達分析

本研究以∣log2(FoldChange)∣>1且FDR<0.01為差異基因篩選標準，通過對紅葉材料和白葉材料的內葉(A vs C)和外葉(B vs D)的基因分別比較發現，內葉有3 726個差異基因，占基因總數的5.85%(3 726/63 653)，其中上調基因1 912個，下調基因1 814個；外葉有2 851個差異基因，占基因總數的4.48%，其中上調為1 263個，下調1 588個(圖2中a)。經過共差異表達Veen圖分析，A vs C 和 B vs D 兩個差異基因集間有共同差異基因1 665個，其中絕大多數基因上調或下調表達方向一致，即共同上調表達基因725個，共同下調表達基因920個(圖2中b)。這些基因極有可能包含影響紅葉性狀形成的關鍵候選基因。

a—差異基因數目；b—差異基因維恩圖分析圖2 差異基因表達情況

對共同差異表達的基因進行GO富集分析，顯著性富集的GO條目分為生物學過程(Biological Process)、細胞組分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)3大類，其中在細胞組分中共同差異表達的基因富集最顯著的條目集中在細胞質(cytoplasm)、核糖體(ribosome)、質體(plastid)等組分；在分子功能中主要的是結合(Binding)；在生物學過程中富集最顯著的條目集中在防御反應(defense response)相關條目，包括對光、低溫、金屬離子、水等的反應(response to light stimulus，response to cold，response to cadmium ion，response to water deprivation)，值得特別關注的是花青素類化合物生物合成過程(anthocyanin-containing compound biosynthetic process)也出現在顯著性富集條目中(圖3)，進一步證實了花青素苷在紅葉性狀的形成中起著關鍵作用。

圖3 共同差異表達基因GO富集分析

2.4 羽衣甘藍花青素苷途徑相關基因差異分析

植物花青素苷途徑相關基因在模式植物擬南芥中的研究已經較為清楚，使用同源比對的方法對羽衣甘藍中花青素苷途徑相關基因進行了鑒定[12,14]。結果表明，在本研究中共鑒定出175個涉及花青素苷途徑的基因，其中上調表達基因有Bo3g024670(C4H)、Bo6g100940(MYB75)和Bo9g008920(5MAT)，下調表達基因包括Bo2g116380(DFR)、Bo6g112670(MYBL2)、Bo6g010860(ACC1)和novel.283(CHI-L1)(表2)。這些基因極可能是羽衣甘藍紅葉性狀形成的關鍵基因，有待深入研究。

表2 花青素苷途徑相關基因差異表達情況

3 討論

羽衣甘藍等彩葉植物葉色的形成相當復雜，主要受內部遺傳因子及外界環境因子共同調控，植物所含色素(主要有葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮類等)的種類、分布及含量等的差異均可導致不同葉色的形成[15-16]。研究[1,3,12]表明，羽衣甘藍紅/紫葉性狀是花青素苷大量積累產生的。本研究通過對紅/白2種不同葉色觀賞羽衣甘藍內外葉片花青素苷含量的測定也驗證了這一觀點，本研究發現在紅葉材料中有大量花青素苷積累，而白葉材料中卻極少積累(圖1中b)。此外，本研究通過對紅葉材料和白葉材料差異基因的GO富集分析發現，花青素苷類化合物合成相關條目被顯著性富集(圖3)，也證實了花青素苷對兩者葉色差異起到重要作用。因此，羽衣甘藍紅葉性狀的研究應該著眼于花青素苷的生物合成調控與積累上。

模式植物擬南芥中花青素苷的代謝合成途徑已較為清楚，同屬十字花科的甘藍與擬南芥親緣關系非常接近，基因組進化分析表明蕓薹屬甘藍相比于擬南芥經歷了基因組三倍化事件[17-19]。因此，采用同源比對的方法可以利用擬南芥已知的花青素苷途徑基因鑒定出甘藍的相應基因，這一方法在蕓薹屬物種中的應用也比較成功。如Guo等[14]通過同源比對的方法鑒定了蕓薹屬白菜(Brassicarapa)的花青素苷途徑基因73個，Ren等[12,20]分別鑒定了蕓薹屬甘藍的花青素苷途徑基因84和81個。本研究綜合不同文獻中擬南芥的花青素苷途徑相關基因，采用同源比對的方法找到了它們在羽衣甘藍中的同源基因，最終也鑒定到了175個花青素苷途徑相關基因。相比前人的研究，本研究中鑒定的基因數目更多、更全面，將更加有利于后續研究者篩選關鍵基因。

本研究最終鑒定到7個候選基因，這些基因包括結構基因(C4H、CHI、DFR)、調控基因(MYB75、MYBL2)和一些其他基因(5MAT、ACC)(表2)。結構基因C4H、CHI、DFR等的高轉錄是花青素苷合成從而顯現紫/紅色的直接原因[21]。肉桂酸羥化酶(C4H)是植物苯丙烷代謝通路中重要的羥基化酶，反肉桂酸被C4H羥基化生成對-香豆酸，再進一步轉化為類黃酮。研究[22]表明，C4H的表達量能有效影響植物中黃酮類化合物的生物合成量。本研究中Bo3g024670(C4H)在紅葉材料中的表達量相比白葉材料顯著性上調表達(表2)，這與Ren等的研究結果一致。Jin等在差異基因中鑒定到一個C4H基因(Bol033349)，在紫葉材料的內葉中的表達量遠高于白葉材料。DFR蛋白特異地催化二氫黃酮醇還原成無色的花色素，是花青素苷合成途徑中的的重要節點之一，很多植物紫色性狀的形成與其有關[21]，在一些羽衣甘藍葉色基因的定位研究中DFR基因也被認為是候選基因[3-4]。本研究中還鑒定到了一個新基因novel.283，功能注釋為一個具有CHI基因類似功能的基因，CHI在類黃酮類物質的生物合成途徑的早期階段起關鍵作用[22-23]，而作為上游底物的類黃酮物質對花青素苷的合成也影響甚大。轉錄調控是花青素苷合成積累的關鍵因素之一，而作為調控樞紐的MBW復合體及其成員在此起到主要作用。MYB75(PAP1)是一種MYB類轉錄因子，最早在擬南芥中證實它參與花青苷生物合成的調控[24]，在很多物種中都有報道，例如番茄內源轉錄因子MYB75的超量表達就能夠大量積累花青素苷并獲得顯著紫色的番茄果實[25]；Zhang等[2]也認為，BoPAP1在低溫誘導羽衣甘藍花青素苷合成和積累過程中發揮重要作用。MYBL2作為花青素苷合成的一個負調控因子最早是在模式植物擬南芥中發現的，AtMYBL2負調控花青素苷的合成[26]。在花青素苷的生物合成途徑中，前體物質之一的丙二酰輔酶A是由乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase，ACC)的催化下羧化形成的[27]，因此，ACC在花青素的合成過程中可能發揮著重要的作用；劉和平[28]研究表明，PhACC1、PhACC2和PhAAE13作為合成丙二酰輔酶A的關鍵酶，在矮牽牛花的花青素生物合成過程中起著重要的作用?；ㄇ嗨剀丈锖铣赏緩降南掠尾糠质遣环€定的花青素在一系列酶的催化作用下(諸如糖基化、?；?、甲基化等)經過修飾轉變為穩定的花青苷的過程。擬南芥花青素苷5-O-葡萄糖苷-6″-O-丙二酰轉移酶(At5MAT)編碼丙二酰-CoA，花青素5-O-葡糖苷-6″-O-丙二酸轉移酶，參與花青素衍生物的酰基化修飾[29]。

高通量測序技術的迅猛發展為羽衣甘藍葉色方面的研究提供了良好的技術手段。近年來，基于比較轉錄組分析的羽衣甘藍葉片呈色的研究報道不斷出現，研究多以紅葉/紫葉材料與白葉材料的比較為主，重點關注了花青素苷、葉綠素及類胡蘿卜素的代謝途徑等相關的基因差異表達情況[11-13]，這些研究為羽衣甘藍葉色形成的機理研究提供了許多新的思路，但是解析羽衣甘藍葉色形成的分子機制仍然任重道遠。本研究通過對羽衣甘藍紅葉材料和白葉材料不同部位的葉片(內葉和外葉)進行轉錄組分析，揭示了不同葉色羽衣甘藍葉片基因表達譜的差異，重點研究了花青素苷途徑相關的差異基因，篩選出了一些花青素苷途徑相關的關鍵基因及調控因子，為進一步解析羽衣甘藍葉色形成機理奠定了良好的基礎。