昌感秋海棠組培及煉苗條件研究

馬菁華 歐明燭 任啟飛 劉芳 楊朔 陳云飛 周艷

摘 要：采用組培培養技術探討昌感秋海棠最佳培養條件。結果表明：選用葉片作為組培外植體更佳，初代、繼代、生根培養的最佳培養基依次為MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA、MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA、1/2MS+0.2mg/L NAA，最佳煉苗基質為珍珠巖∶蛭石∶泥炭蘚=1∶1∶2。

關鍵詞：昌感秋海棠;組培;生根培養;煉苗

中圖分類號 S661.4 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）15-0039-03

Study on Tissue Culture and Strong Seedling Stress of Begonia Cavaleriei

MA Jinghua et al.

（Guizhou Botanical Garden， Guiyang， Guiyang 550004， China）

Abstract： The study was focused on the best conditions of tissue culture of Begonia Cavaleriei. The results showed that the best explants for tissue culture came to be the leaves， and the best medium for primary culture， subculture and rooting culture were MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA， MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA， 1/2MS+0.2mg/L NAA， respectively. The best seedling substrate was perlite+vermiculite+sphagnum（1∶1∶2）.

Key words： Begonia cavaleriei; Tissue culture; Rooting; Seedling stress

昌感秋海棠（Begonia cavaleriei Levl）是秋海棠科秋海棠屬的多年生草本植物，葉片翠綠，盾形，厚紙質;白色至粉紅色花朵，聚傘狀，嬌小可愛，可作觀賞。昌感秋海棠為中國特有種，分布在貴州、廣西、云南等地[1]，野生昌感秋海棠生于山溝巖壁或石縫隙、山腳蔭密林下等蔭濕處，生境較脆弱。另外，昌感秋海棠也是傳統的中藥材，全草可入藥，有抗炎止痛等功效，是我國少數民族常用中草藥[2]。由此可見，昌感秋海棠是重要的野生花卉資源，且有藥用功效，具有較好的開發利用價值，但其生境面臨一定威脅。秋海棠常見的繁殖方式包括種子繁殖、珠芽繁殖、塊莖繁殖、葉片扦插、組織培養等。種子繁殖的后代易產生變異;珠芽繁殖受到葉片和珠芽數量的限制;扦插需要較多葉片且受季節影響，無法實現快速高效繁殖;組培可以在短時間內獲得大量后代，且很好地保持品種的優良性能，已有多種秋海棠屬植物組培成功[3-6]。為此，筆者開展昌感秋海棠的組培再生體系研究，為保護秋海棠種質資源提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 昌感秋海棠于2017年采自貴州施秉，帶土移栽于貴州省植物園。引種栽培1年后，昌感秋海棠已完全適應本地環境，在植物園內生長良好[7]，已經進行大量繁殖。于天氣晴朗時選取生長健壯的植株，取其葉片和葉柄作為外植體。

1.2 外植體處理 將昌感秋海棠連同葉柄剪下，帶回實驗室用自來水沖洗10min后轉移至超凈工作臺，將葉片和葉柄分離，葉柄剪成5cm左右小段，葉片剪5cm×5cm的小片，然后用75%酒精浸泡10s，無菌水沖洗4次，10%NaClO溶液浸泡10min，無菌水沖洗5次，然后將外植體置于無菌濾紙片上吸干水分，葉片剪成1cm2左右的小塊，葉柄剪成1cm左右的小段，接種于事先準備好的滅菌培養基中。

1.3 愈傷組織誘導 將消毒好的外植體接種到初代培養基中，以MS為基本培養基，設計細胞分裂素6-BA和生長素NAA不同濃度組合：6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，6-BA 3mg/L+NAA 0.4mg/L，6-BA 4mg/L+NAA 0.5mg/L。每處理接種6瓶，每瓶5個外植體，一定時間后統計愈傷組織誘導率。

愈傷組織誘導率（%）=形成愈傷組織的外植體數/接種的外植體數

1.4 叢生芽誘導分化 以MS為基本培養基，設計6-BA、NAA和赤霉素GA不同濃度組合：6-BA（1mg/L，2mg/L）+NAA（0.2mg/L，0.3mg/L）+GA（0.4mg/L，0.5mg/L），接種愈傷組織，設8個處理，每處理接種5瓶，每瓶4個外植體，每隔7d觀察愈傷組織分化為叢生芽的數量，一定時間后統計叢生芽分化率。

芽分化率（%）=愈傷組織再分化成芽的外植體數/接種的外植體數

1.5 壯苗與生根誘導 以1/2或1/3MS為基本培養基，添加IAA或NAA，共6個處理，將較大的叢生芽剪切為數個大小合適的芽接種到培養基中。每處理接種4瓶，每瓶2～3個叢生芽，一定時間后統計生根數和生根率，對比各處理苗的生長狀況。生根率為長根叢生芽占總接種叢生芽的數量比率;平均根數以叢生苗為基數，統計每株叢生苗生發的根數，計算平均值。

1.6 無菌組培苗煉苗 將生根的無菌組培苗取出，清洗根部培養基，適當修剪根長，在50%多菌靈溶液中蘸取2次以對根部進行殺菌，將組培苗接種于4種不同組合的基質中。基質組合為：珍珠巖+蛭石（1∶1）、珍珠巖+蛭石+泥炭蘚（1∶1∶2）、珍珠巖+蛭石+水苔+樹皮（1∶1∶1∶1）、水苔+泥炭蘚（1∶2）。移栽初期每3d適量澆水，植株適應基質后進行4周的濕潤訓練，每2d充足澆水1次，之后進行4周的干旱訓練，每周1次充足澆水，其余時間不補水。每處理16株組培苗，觀察并統計移栽苗的生長情況。

1.7 培養條件 愈傷組織誘導至不定芽生根，所有培養過程在光照培養箱中進行，培養條件為日間模式14h（光照強度1200lx、25℃），夜間模式10h、20℃。煉苗在溫室中進行，自然光照及溫度。

2 結果與分析

2.1 不同外植體和激素組合對愈傷組織誘導的影響 外植體接種到初代培養基15d后，各處理外植體邊緣開始膨大形成愈傷組織。接種30d后統計愈傷組織分化率。由表1可知，各組合下外植體開始分化的時間不同，且以葉片較早。較低激素濃度組合下，外植體幾乎沒有玻璃化現象發生，當濃度達到3mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA時，葉柄出現一定玻璃化，濃度再增加時葉片也開始玻璃化，但總體玻璃化程度較輕，在10%以內。褐化現象與玻璃化趨勢相反，在較低激素濃度組合時褐化較嚴重，達到20%，隨著濃度升高，褐化減輕，低至3.3%。外植體的分化率總體較高，MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 組合下葉柄分化率大于葉片，為86.7%，其他激素組合分化率均在90%以上，且葉片分化率更高，在MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA的組合下達到100%。由此可見，葉片和葉柄均可誘導形成愈傷組織，但綜合考慮試驗時間和愈傷組織誘導率，選用葉片作為組培外植體更佳，且以2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA的激素組合最適于外植體分化。

2.2 不同激素組合對叢生芽誘導分化的影響 愈傷組織轉接到繼代培養基后繼續培養，誘導叢生芽的分化，約2周后開始分化形成叢生芽，30d后統計結果，形成叢生芽的外植體數占總接種外植體的比例為增殖率，叢生芽高度大于0.5cm的外植體占形成叢生芽的外植體的比例為大芽比率。由表2可知，所有激素組合中，昌感秋海棠愈傷組織在繼代培養中沒有玻璃化，但有不同程度的褐化現象發生;總體增殖率在60%以上，受6-BA含量影響較大，6-BA含量較高時增殖率較高;叢生芽高度多數在0.5cm以下，僅2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA組合有50%以上叢生芽高度超過0.5cm，因此繼代培養以該激素組合為最佳組合，能在較短時間內得到較多、較為理想的叢生芽。

2.3 不同培養基和激素組合對生根壯苗誘導的影響 36d后，各處理組培苗葉片明顯長大，且均明顯生根，已長成為正常形態的植株。由表3可知，各組合對昌感秋海棠無菌苗誘導生根的能力均較強，生根率在90%以上，但生根數量有所不同，且根與植株長勢因培養基有所差異。總體而言，1/2MS作為基礎培養基優于1/3MS。組培苗平均根數量方面，以1/2MS為基礎培養基時植株生根數量在5.3以上，1/3MS時在5.8以下，前者更有利于生發更多新根;根形態方面，以1/2MS為基礎培養基時植株根系較粗，健康茁壯，而1/3MS時根系細弱，不利于根系吸收養分為地上部供給養分;植株長勢與根系形態關系密切，以1/2MS為基礎培養基時植株總體長勢較好，而1/3MS時植株矮小。其中，1/2MS+0.2mg/L NAA的組合生根壯苗效果最好，生根率達到100%，且生根數量適中，根系發達，植株健壯，葉片翠綠茂密，總體更加有生機。

2.4 不同基質對組培苗生長的影響 各煉苗基質對無菌組培苗的影響不同。由表4可知，適應2周后，絕大多數組培苗生長良好，尤以珍珠巖+蛭石+泥炭蘚（1∶1∶2）和水苔+泥炭蘚（1∶2）的基質配比為佳，成苗率達100%;植株適應基質后進行為期30d的濕潤訓練，每2d充足澆水1次，此時珍珠巖+蛭石+水苔+樹皮（1∶1∶1∶1）的基質因為疏水透氣較好而保持較高的成苗率;之后進行為期30d的干旱訓練，每周僅充足澆水1次，此時珍珠巖+蛭石（1∶1）和珍珠巖+蛭石+水苔+樹皮（1∶1∶1∶1）的基質因保水能力差而死苗嚴重，達100%，而珍珠巖+蛭石+泥炭土（1∶1∶2）和水苔+泥炭蘚（1∶2）因其持水保水能力強而維持較好的成苗率，前者成苗率達70%。由此可見，珍珠巖+蛭石+泥炭土的基質組合能同時達到理想的疏水和保水能力，有利于昌感秋海棠的生長。

3 結論與討論

試驗結果表明：昌感秋海棠組培繁育時，選用葉片作為組培外植體，培養基中添加2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA，初代培養效果最佳;培養基中添加2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA有助于叢生芽的形成與生長，繼代培養效果最理想;以1/2MS為基礎培養基，添加0.2mg/L NAA，生根壯苗效果最好，生根率100%，且植株長勢旺盛，根葉繁茂;選用珍珠巖∶蛭石∶泥炭蘚=1∶1∶2的基質進行煉苗可以達到最佳效果，此時組培苗既能適應濕潤的多水環境，又能承受較為長期的干旱環境。試驗過程中應注意控制培養基的濕度和培養條件，降低玻璃化與褐化現象的發生幾率。本研究成果可在短時間內繁殖大量秋海棠無菌組培苗，為昌感秋海棠物種保護和繁育提供技術交換。

參考文獻

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（責編：徐世紅）

基金項目：貴州科學院省級科研專項資金項目“貴州喀斯特植物資源保育平臺建設”黔科院科專合字[2019]07號;貴州科學院基金“秋海棠屬植物種質資源收集及利用評價”黔科院字[2017]02號。

作者簡介：馬菁華（1991—），女，河南焦作人，碩士，研究實習員，從事植物資源收集與保護工作。

通訊作者 ?收稿日期：2021-06-03