多光譜法和分子對接模擬法研究黃腐植酸和牛血清白蛋白的相互作用

王曉霞， 吳 昊， 聶智華， 馬力通， 崔金龍， 賽華征， 成建國

1. 內蒙古科技大學化學與化工學院， 內蒙古 包頭 014010 2. 清華大學生命科學學院， 北京 100084 3. 生物煤化工綜合利用內蒙古自治區工程研究中心， 內蒙古 包頭 014010

引 言

黃腐植酸(fulvic acid， FA)為腐植酸中的一種， 其結構中含有較多的活性基團， 具有水溶性好， 分子量小等特點， 是一種良好的免疫佐劑[1]。 近年來， 在醫藥等領域表現突出， 如Winkler John[2]等研究黃腐植酸對于慢性疾病和糖尿病的療效； Jayasooriya Rajapaksha Gedara Prasad Tharanga[3]等研究黃腐植酸可能具有刺激免疫調節作用， 誘導癌細胞死亡等功效。 血清白蛋白是人和動物的血漿中最豐富的蛋白質， 作為血液緩沖劑、 維持血漿滲透壓和運載藥物小分子， 生物體內承擔重要作用。 牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)與人血清白蛋白在結構上類似， BSA更容易獲得也更為廉價， 這些特點使得BSA常用來做研究小分子與蛋白質相互作用的理想模型。 FA分子結構中的含有多個具有活性的酚羥基和羧基， 可以與藥物載體血清白蛋白結構中的活性基團相互作用。 本研究能為FA類新藥物的開發及未來對于研究FA藥物對人體的作用提供一定的數據參考。 同時通過本實驗FA與BSA相互作用的探究也對FA的性能和其對于蛋白質結構功能的影響具有重要理論價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器： 熒光分光光度計(LS-55,美國PerkinElmer公司)； 紫外-可見近紅外分光光度計(CARY 5000， AGILENT TECHNOLOGIES有限公司)； 圓二色譜儀(Chirascan plus， 英國應用光物理公司)。 試劑： FA(純度≥98%)(合肥巴斯夫生物科技有限公司)； BSA(純度≥98%)(上海金穗科技有限公司)； 三羥甲基氨基甲烷(tris hydroxymethyl aminomethane， Tris， 分析純)(天津市光復精細化工研究所)。

1.2 溶液配制

分別配制pH 7.40， 濃度為0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液、 0.5 mol·L-1的NaCl溶液、 5×10-5mol·L-1的BSA儲備液。 準確移取BSA儲備液后加入濃度為0.5 mol·L-1NaCl溶液20 mL， 用pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容至100 mL， 得到濃度為5×10-6mol·L-1的牛血清白蛋白溶液； 配制濃度為1.5×10-3mol·L-1的黃腐植酸溶液： 用天平準確稱取黃腐植酸藥品粉末0.049 3 g， 充分溶解后定容至100 mL， 得到濃度為1.5×10-3mol·L-1的黃腐植酸溶液。

1.3 方法

1.3.1 測定不同溫度下FA-BSA的熒光光譜

取9支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到試管內BSA濃度為5×10-7mol·L-1， FA濃度從低到高依次為(0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2和4.8)×10-4mol·L-1， 搖勻后靜置20 min后放入恒溫水浴箱， 將溫度分別設置為298， 303和308 K， 在不同溫度下加熱20 min后取出,使用熒光光度計進行測量。 設置熒光激發波長280 nm， 狹縫寬度均為10 nm， 掃描速度1 500 nm·min-1， 發射波長290～550 nm， 記錄相對應的熒光值。

1.3.2 測定FA-BSA的同步熒光光譜

取9支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到比色管內BSA濃度為5×10-7mol·L-1， FA濃度從低到高依次為(0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2和4.8)×10-4mol·L-1， 震蕩搖勻后待測。 在熒光光度計同步熒光激發波長280 nm， 狹縫寬度均為9 nm， 掃描速度1 500 nm·min-1條件下， 分別掃描測定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm下體系的同步熒光光譜。

1.3.3 測定FA-BSA三維熒光光譜

選用兩支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到兩支試管內溶液濃度為： BSA為2.5×10-7mol·L-1， FA為 3.0×10-5mol·L-1。 震蕩搖勻后待測。 在三維熒光激發波長200 nm， 狹縫寬度7.0 nm條件下， 設置發射波長200～500 nm， 掃描速度為1 500 nm·min-1， 分別測量40組發射波長間隔為5 nm的三維熒光光譜。

1.3.4 測定FA-BSA的紫外-可見光吸收光譜

分別移取適量BSA和FA至比色管， 定容后試管內BSA濃度為5×10-7mol·L-1， FA濃度從低到高依次為(0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2和4.8)×10-4mol·L-1， 震蕩搖勻后待測。 用紫外分光光度計掃描紫外-可見吸收光譜， 掃描波長190～450 nm， 波長間隔1 nm的條件下測量紫外-可見吸收光譜。

1.3.5 測定FA-BSA結合距離

取3支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到三個試管溶液濃度為： BSA為5×10-7mol·L-1； FA為5×10-7mol·L-1； BSA為5×10-7mol·L-1， FA為5×10-7mol·L-1。 震蕩搖勻后靜置待測。 在熒光光譜儀激發波長280 nm， 狹縫寬度8.0 nm條件下， 掃描波長范圍為290～550 nm， 設置掃描速度500 nm·min-1， 測量并得到FA和FA-BSA的熒光光譜。 在紫外分光光度計掃描波長190～450 nm， 參數波長間隔1 nm的條件下， 測量并得到FA的紫外-可見吸收光譜。

1.3.6 測定FA-BSA圓二色譜

取2支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到溶液濃度為： BSA濃度為1×10-5mol·L-1； BSA濃度為1×10-5mol·L-1， FA濃度為4×10-5mol·L-1。 圓二色譜儀掃描波長范圍為180～260 nm， 狹縫寬度8.0 nm， 時間0.5 s， 用Tris-HCl作為參比， 記錄BSA與FA-BSA體系的圓二色譜。

1.3.7 分子對接模擬

使用ChemDraw Professional 15.1軟件繪制FA的分子結構式， 選取蛋白質數據庫RCSB Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/bdb/home/home.do)中BSA晶體結構， 使用分子對接軟件Accelrys Discovery Studio 3.5進行分子對接模擬。

2 結果與討論

2.1 FA與BSA作用的熒光猝滅光譜

由于BSA分子含有酪氨酸(Tyr)、 色氨酸(Trp)、 苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基能使得BSA分子具有強烈的內源性熒光， FA溶液加入BSA溶液后， 出現熒光猝滅現象。 圖1(a,b,c)是在溫度分別為298,303和308 K下， BSA與不同濃度的FA溶液所產生的熒光強度變化情況。 由圖1分析對比可知， 激發波長280 nm， BSA最大發射波長為346 nm， 隨著FA溶液濃度增加， BSA熒光強度呈規律下降， 發射峰的位置與峰型卻沒有明顯改變， 因此可得出FA對BSA產生熒光猝滅作用， 兩者發生相互作用。

圖1 不同溫度下BSA-FA體系相互作用的熒光發射光譜圖(a): 298 K； (b): 303 K； (c): 308 K; c(BSA)=5×10-7 mol·L-1；c(FA)(1—9): (0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2， 4.8)×10-4 mol·L-1; pH 7.40Fig.1 Fluorescence emission spectra of BSA-FA interaction system under different temperature(a): 298 K； (b): 303 K； (c): 308 K; c(BSA)=5×10-7 mol·L-1；c(FA)(1—9): (0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2， 4.8)×10-4 mol·L-1; pH 7.40

2.2 FA與BSA相互作用的熒光猝滅類型

熒光猝滅過程分為動態和靜態猝滅， 動態猝滅是猝滅劑FA與熒光激發態分子BSA之間相互碰撞， 使得熒光強度降低， 不會影響到BSA的構象； 熒光猝滅過程中靜態猝滅則是基態下熒光分子與猝滅分子形成不發光的基態配合物， 使得熒光減弱,蛋白質分子結構發生改變[4]。 實驗采用Stern-Volmer方程[5]進行處理來判斷猝滅類型

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式(1)中，FA溶液作為猝滅劑， F0為不加入FA溶液時體系的熒光強度； F為加入FA溶液后體系的熒光強度； [Q]為實驗測量最終FA溶液的濃度， KSV為動態猝滅常數， Kq為動態熒光猝滅速率常數； τ0為當猝滅劑FA不存在時， 熒光分子的平均熒光壽命， 通常取值10-8s。 以[Q]為橫軸， F0/F為縱軸， 作298， 303和308K溫度下該體系的Stern-Volmer曲線,并擬合得到方程與相關系數， 見表1。

由表1可知， 在298， 303和308K下計算得到Kq值均遠大于最大擴散碰撞猝滅速率常數2.0×1010L·mol-1·s[6]。 證明FA主要通過靜態猝滅來降低BSA的熒光強度， 且猝滅常數在298， 303和308K下的數值隨著溫度升高而降低， 進而更表明FA與BSA作用為靜態猝滅。

表1 Stern-Volmer線性方程以及相關系數Table 1 Stern-Volmer linear equations and correlation coefficients

2.3 FA與BSA相互作用的結合常數與結合位點數

已證明FA與BSA相互作用的熒光猝滅類型為靜態猝滅， 則靜態猝滅雙對數公式[7]適用于該反應體系

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式(2)中， KA為FA和BSA的結合常數； n為FA與BSA的結合位點數； F0為不加入FA溶液時體系的熒光強度； F為加入FA溶液后體系的熒光強度。 以lg[(F0-F)/F]的值作為縱坐標， 以lg[Q]的值作為橫坐標作圖， 其直線斜率即為結合位點數n， 結合常數KA為直線截距的負對數值， 見表1。 從表1可知， 三個溫度下結合常數KA都較大， 結合位點數在1附近， 證明FA與BSA結合力較強， 且該體系相互作用所形成的復合物為1∶1型。 同時， 結合常數數值隨著溫度的上升而減小， KA(298K)>KA(303K)>KA(308K)， 與猝滅常數隨溫度變化規律一致， 進一步證明了FA與BSA體系猝滅類型為靜態猝滅。

2.4 FA與BSA相互作用的熱力學參數和主要作用力

藥物小分子與蛋白質相互之間通過不同的作用力相互作用形成配合物， 相互作用力的表現形式主要有氫鍵、 疏水作用力、 靜電引力和范德華力。 通過Van’t Hoff公式[8]計算得到反應體系的熵變ΔS與焓變ΔH， Van’t Hoff公式與反應的吉布斯自由能公式如式(3)—式(5)

lnKA=-ΔH/RT+ΔS/R

(3)

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKA

(5)

式(3)—式(5)中，ΔG反應的吉布斯自由能； KA是結合常數； R為摩爾氣體常數(取R=8.314J·mol-1·K)； T為試驗溫度。 根據式(3)—式(5)求得ΔH=-33.48KJ·mol-1，ΔS=-40.78J·mol-1·K和ΔG=-20.95kJ·mol-1(298K)， -21.12kJ·mol-1(303K),-20.92kJ·mol-1(308K)。 根據Ross[9]理論可知，FA與BSA體系的熱力學參數ΔH<0，ΔS<0表明體系中兩者之間的作用力為氫鍵和范德華力；ΔG<0表明反應為自發反應， 同時本反應為放熱反應(ΔH<0)。

2.5 FA與BSA體系結合距離的計算

按照F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移機理[10-11]， 該體系滿足以下關系式

J=∑FD(λ)εA(λ)λ4Δλ/∑FD(λ)Δλ

(8)

式(6)—式(8)中： F為在BSA與FA體系中FA與BSA濃度比為1∶1時BSA的熒光強度， F0為只有蛋白質BSA時測得的熒光強度， r為BSA與FA之間的結合距離； R0為E=50%時的臨界距離； k2為偶極空間取向因子， 取平均值2/3； n為介質的折射指數， 取水和有機物的平均值1.336； φ為BSA的熒光量子產率， 取色氨酸(Trp)殘基量子產率φ=0.15； J為BSA的熒光發射光譜與FA紫外吸收光譜間的光譜重疊積分； FD(λ)為BSA在波長λ處的熒光強度； εA(λ)為受體FA在波長λ處的摩爾吸光系數。

BSA的熒光光譜曲線與FA的紫外吸收光譜曲線的重疊圖見圖2， 圖2重疊部分說明FA與BSA之間存在非輻射能量轉移。 根據式(6)—式(8)計算得到重疊積分J=2.021×10-15cm3·mol·L-1， E=18.30%， R0=4.79nm， r=6.340nm。 結果表明，FA與BSA相互作用的結合距離r<7nm， 同時0.5 R0

圖2 BSA的熒光發射光譜(a)與FA的 紫外吸收光譜(b)的重疊圖Fig.2 Overlapping of the fluorescence emission spectra (a) of BSA and with the absorption spectra (b) of FA c(BSA)=c(FA)=5.0×10-7 mol·L-1

2.6 FA與BSA分子對接模擬

分子對接技術可以更清晰地了解BSA分子的二級結構改變和FA與BSA相互作用體系中的作用力類型。 利用分子對接模擬軟件繪制出FA與BSA相互作用體系的分子對接模擬圖， 如圖3所示。 圖3(a)和(b)中， BSA立體結構呈現心型且FA分子位于BSA的活性中心， FA與BSA結合位點靠近BSA亞結構域ⅢB(Subdomain ⅢB)site Ⅱ點。 為進一步觀察FA與BSA相互作用的微環境， 列出FA結合位點附近對結合作用影響較為明顯的氨基酸殘基， 見圖3(c)。 圖3(c)中， FA與BSA的氨基酸殘基之間存在范德華力(Van der waals)的有： HIS534， GLN579， LEU582， LYS535， LEU531， THR578， PHE508， PHE553， GLY571和PRO572。 FA與GLU503和THR507氨基酸殘基之間為氫鍵作用力(Conventional Hydrogen Bond)， FA與GLU503氫鍵鍵長為5.45 ?， FA與THR507氫鍵鍵長為3.19 ?。 FA與BSA中PHE501， VAL575和PHE506氨基酸殘基之間存在不利于碰撞作用力(Unfavorable Bump)， FA與PHE501鍵長為4.69 ?， FA與VAL575不利于碰撞鍵長為3.64 ?， FA與PHE506鍵長為5.34 ?。 FA與BSA中PHE506和LEU574殘基存在疏水作用力(以Pi-alkyl與Pi-Pi Stacked形式存在)， FA與PHE506鍵長為4.60 ?， FA與LEU574疏水作用力鍵長為6.26 ?。 上述結果證明了FA與BSA相互作用使二者可穩定結合， 表明了BSA二級結構微環境的變化。

圖3 FA-BSA分子對接結果(a)： FA-BSA分子對接模擬圖； (b)： FA-BSA分子對接模擬飄帶圖； (c)： FA-BSA的氨基酸殘基的2D、 3D示意圖Fig.3 The molecular docking result of FA with BSA(a)： Molecular docking simulation of FA and BSA； (b)： Streamer shape molecular docking model diagram of FA and BSA；(c)： 2D and 3D schematic diagram of amion residues of FA and BSA

2.7 FA對BSA二級結構的影響

2.7.1 FA與BSA相互作用的紫外-可見吸收光譜

用紫外光譜可以探索FA對BSA的結構改變， 模擬生理條件下， 分別測定BSA和FA與BSA體系的紫外-可見吸收光譜， 見圖4。 由圖4可知， 體系的紫外吸收峰在280 nm左右出現， 隨FA濃度的不斷增大， 最大吸收峰紅移了3 nm， 分析認為由于FA與BSA堿基對發生了電子堆積， FA的空軌道與堿基的電子軌道發生耦合， 發生了躍遷， 吸收光波的能量減小[12-13]， 使BSA周圍微環境極性增大， 疏水性減小， 親水性增大， 證明FA使BSA的二級結構發生了改變。

圖4 FA-BSA作用體系的紫外吸收光譜圖

2.7.2 FA與BSA相互作用的同步熒光光譜分析

同步熒光光譜可以明確反映出蛋白質氨基酸殘基周圍微環境的變化， 對體系進行了同步熒光光譜測定， 見圖5。 由圖5可知， 在BSA的濃度保持不變的情況下， 隨著FA濃度梯度的升高， 圖5(a)中Δλ=15 nm下對應表征的酪氨酸(Tyr)殘基同步熒光光譜的最大發射波長基本維持不變， 峰型無明顯變化， 熒光強度猝滅程度較弱； 而圖5(b)中Δλ=60 nm下對應表征的色氨酸(Trp)殘基同步熒光光譜的最大發射波長紅移了3 nm， 且熒光猝滅程度較強， 這說明FA使BSA中的色氨酸(Trp)殘基周圍的微環境極性增強， 疏水性減弱， 親水性增強， 使得BSA的構象發生了一定程度的改變， 證明FA作用在BSA的色氨酸(Trp)殘基上， 使BSA的二級結構發生改變。

圖5 FA-BSA作用體系的同步熒光光譜圖

2.7.3 FA與BSA相互作用的三維熒光光譜分析

為進一步研究FA與BSA的結合對BSA產生結構及在微環境的影響， 對體系進行三維熒光光譜測定， 見圖6、 圖7。 由圖6、 圖7可知， 峰1(peak 1)與峰2(peak 2)的熒光強度都發生了較大程度的降低， 且兩峰都在最大發射波長處出現了紅移現象， 峰1(peak 1)最大發射波長峰紅移了1 nm， 峰2(peak 2)最大發射波長峰紅移了4 nm， 證明FA與BSA發生了相互作用， FA使BSA周圍環境的極性增大， 疏水性減弱， 親水性增強， 使BSA的蛋白質構象發生變化。 圖6(a,b)、 圖7(a,b)中， 呈現“山脊”形狀的峰a(peak a)、 峰b(peak b)稱為瑞利散射峰(λex=λem)； 呈現“駝峰”形狀的峰1、 峰2為典型的熒光峰(2λex=λem)， 其中峰1表征酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基,峰2涉及多肽骨架結構， 表征BSA的二級結構[14-15]。 當BSA溶液未加入FA時， 兩峰的特征參數(λex/λem， F)分別為peak 1(280/343,271.8)， peak 2(225/340,664.3)， 峰1與峰2的熒光強度比為1∶2.44； 當加入FA溶液后， FA與BSA相互作用體系的兩熒光峰特征參數(λex/λem， F)為peak 1(280/344,220.5)， peak 2(225/344,503.9)， 峰1與峰2的熒光強度比為1∶2.28。 從峰1和峰2的熒光強度進行分析， 加入FA溶液后， BSA的瑞利散射峰peak a和peak b和熒光峰的強度都發生明顯下降， 表明BSA與FA發生相互作用后， BSA的分子表面被破壞， 蛋白質分子更加分散， 即發生解聚作用， 進而使蛋白質粒徑減小， 熒光強度減弱， 進一步證明FA使BSA的二級結構發生了改變。

圖6 BSA溶液的三維熒光光譜圖(a)和等高線圖(b)c(BSA)=2.5×10-7 mol·L-1； pH 7.40； T=298 KFig.6 Three-dimensional fluorescence spectrumand contour map of BSAc(BSA)=2.5×10-7 mol·L-1； pH 7.40； T=298 K

圖7 FA-BSA溶液的三維熒光光譜圖(a)和等高線圖(b)c(BSA)=2.5×10-7 mol·L-1；c(FA)=3.0×10-5 mol·L-1； pH 7.40； T=298 KFig.7 Three-dimensional fluorescence spectrumand contour map of FA-BSAc(BSA)=2.5×10-7 mol·L-1；c(FA)=3.0×10-5 mol·L-1； pH 7.40； T=298 K

2.7.4 FA與BSA相互作用的圓二色光譜分析

為進一步研究FA對BSA構象的影響， 掃描并記錄BSA與FA濃度比1∶0和1∶4體系的圓二色譜圖,見圖8。 從圖8可得BSA在208 nm處和224 nm處出現兩個負峰， 負峰代表BSA中α-螺旋(α-Helix)結構的特征峰。 將圓二色譜值導入CDNN setup v2.1軟件， 軟件自動計算得出BSA與FA-BSA相互作用體系特征二級結構的含量值。 在BSA與FA濃度比1∶0和1∶4體系中， α-螺旋占比由22.25%降至19.9%， β-折疊占比由25.8%增至33.55%， β-轉角占比由17.85%增至18.45%， 無規則結構占比由34.8%降至33.6%。 二級結構含量值的變化表明， FA與BSA發生了相互作用， FA改變了BSA周圍的微環境， 使BSA的二級結構發生了變化。

圖8 BSA和FA-BSA體系的圓二色譜圖

3 結 論

采用熒光光譜法、 紫外光譜法、 圓二色譜法、 三維熒光光譜法、 同步熒光光譜法與分子對接模擬法研究黃腐植酸與牛血清白蛋白相互作用的反應機理。 熒光光譜表明FA與BSA相互作用猝滅過程為靜態猝滅。 根據Ross理論計算熱力學參數與FA-BSA作用力類型得出， FA和BSA之間的主要作用力為氫鍵和范德華力， 作用過程自發放熱。 通過F?rster’s共振能量轉移理論計算得出BSA與FA結合距離為6.340 nm， 表明FA與BSA之間發生非輻射能量轉移。 分子對接模擬結果表明FA與BSA之間結合作用力除了氫鍵、 疏水作用力和范德華力， 兩者之間還存在不利于碰撞的作用力。 紫外—可見吸收光譜， 同步熒光光譜， 三維熒光光譜和圓二色譜都表明FA使BSA二級結構發生改變， FA使BSA中的色氨酸(Trp)殘基周圍的微環境極性增強， 減弱其疏水性， 增強其親水性。 這些結果闡明了在分子水平上黃腐植酸對于血清白蛋白的作用機理， 對未來深入研究黃腐植酸在體內的作用和黃腐植酸在醫藥用途上的研究和開發， 具有重要的參考價值與實際意義。