秸稈-牛糞發酵過程中溶解性有機質的熒光光譜特征

李 艷， 魏 丹*， 王 偉， 金 梁， 丁建莉， 蔡姍姍， 胡 鈺， 白 楊

1. 東北農業大學資源與環境學院， 黑龍江 哈爾濱 150030 2. 北京市農林科學院植物營養與資源研究所， 北京 100097 3. 黑龍江省農業科學院土壤肥料與環境資源研究所， 黑龍江 哈爾濱 150086 4. 沈陽農業大學土地與環境學院， 遼寧 沈陽 110866

引 言

隨著我國農作物年產量增加， 秸稈處理難、 利用率低已成為農業綠色、 可持續發展的難點問題[1]。 同時， 畜禽養殖量增加導致畜禽糞便量積累， 需要通過安全的手段將農業、 畜牧業產生的有機廢棄物通過生物代謝作用進行轉化， 形成的物質富含大量的腐殖酸， 可為農業生產的有機肥提供養分來源[2]。 以牛糞、 秸稈為發酵原料， 經過堆腐形成有機肥料在農業生產中被廣泛使用[3]。

溶解性有機物(dissolved organic matter,DOM)是生態系統中能量輸入的活躍成分和物質循環的重要組成部分[4]， 因其具有高度流動性、 不穩定性， 可以對物質遷移和轉化產生影響[5-7]。 目前， 國內外對于DOM的研究主要集中于其來源、 分布、 組成特征、 遷移轉化規律和生物毒性等方面， 研究所采用技術主要為紫外-可見光譜、 三維熒光光譜、 核磁共振和傅里葉變換紅外光譜等， 并借助多元統計方法對DOM進行定量或定性分析[5-8]。

研究有機物料發酵過程中DOM組分結構對了解發酵及腐熟度具有十分重要的意義， 如Xie等[2]利用三維熒光光譜技術結合二維相關光譜和結構方程解析方法， 以綜合分析畜禽糞便和秸稈堆肥過程中胡敏素合成和演化機制及影響因素。 Gao等[9]利用三維熒光光譜技術和傅里葉變換紅外光譜技術對堆肥腐殖化過程研究結果表明， 與秸稈相比， 糞污穩定性和腐殖化程度較低， 腐殖化過程具有多個相同的熒光結構， 而秸稈腐殖化程度主要受含碳物質的影響。 張豐松等[10]利用三維熒光光譜技術測定豬糞、 牛糞發酵后的DOM熒光特性結果得出， 畜禽糞便堆肥發酵后DOM組成發生變化， 含有大量的富里酸和胡敏酸， 并與畜禽糞便中的重金屬Cu發生絡合作用， 使絡合物的遷移性和生物可利用性降低。

基于此， 本研究選擇玉米秸稈和牛糞進行有氧發酵， 按照不同體積比例進行處理， 通過三維熒光光譜技術結合平行因子分析法對發酵過程中樣品DOM熒光特性進行分析， 分析發酵時間及不同比例對DOM組成和結構的影響； 為進一步探討玉米秸稈-牛糞發酵過程中DOM的遷移轉化和變化規律提供科學依據； 對生產實踐中提高堆肥腐熟度和堆肥品質， 選擇最優物料比例和提高秸稈利用率具有十分重要的理論與實際意義。

1 實驗部分

1.1 材料

玉米秸稈采自黑龍江省哈爾濱市道外區民主鄉光明村， 將田間玉米收獲后所得的秸稈風干， 粉碎至平均長度約為3 cm； 牛糞采自哈爾濱市民主鄉光明村農戶家， 為圈養牛的新鮮糞便。 玉米秸稈和牛糞基本理化性質見表1。

表1 玉米秸稈和牛糞的基本理化性質Table 1 Basic physiochenmical properties of corn straw and cow dung

1.2 方法

實驗地點設置在黑龍江省農業科學院晾曬場， 通風條件良好。 發酵過程在塑料材質的小型發酵保溫箱(80 L)中進行， 發酵箱密閉條件良好(發酵箱內安裝有溫度計， 檢測發酵過程中溫度控制)。 實驗設置4個處理， 按照玉米秸稈∶牛糞， 體積比分別為2∶8(T1)、 4∶6(T2)、 6∶4(T3)和8∶2(T4)， 每個處理重復3次。 堆肥發酵前先將粉碎的玉米秸稈與牛糞按體積比混合均勻， 用尿素將C/N比調整為25∶1。 發酵實驗期間， 每隔4 d進行翻堆(用鐵鍬進行上下攪拌)， 并調節發酵物料含水量， 使其水分含量維持在55%～60%。 所有處理同時進行， 自2019年5月7日至2019年6月17日， 共計40 d。 分別采集第5， 10， 15， 20， 25， 30， 35和40 d的樣品， 共采集8次。 采樣時每個處理從保溫箱體(上部、 中部、 下部)各取60 g， 取樣3次重復后混合均勻。 去除雜質后將樣品自然風干， 粉碎過篩(孔徑2 mm)， 在常溫下保存備用。

參考文獻[11]的方法， 本研究取風干粉碎后樣品5 g， 加入雙蒸水(Milli-Q,電阻率為18.2 MΩ·cm-1)， 質量體積比[W(g)∶V(mL)]為1∶10， 室溫條件下水平振蕩(200 r·min-1) 24 h。 用離心機離心20 min (4 ℃,12 000 r·min-1)， 上清液過孔徑為0.45 μm的濾膜， 濾液即為DOM。 利用multi N/C 2100型TOC分析儀(Analytik Jena AG,德國)測定樣品溶液DOM濃度， 稀釋溶液DOM濃度調至15 mg·L-1。

利用熒光光譜測定儀(日立F-7000型,日本)測定溶液DOM熒光特性， 參數設置同樣參考文獻[11]的方法： PMT電壓： 700 V； 激發光源： 450 W氙弧燈； 信噪比>110； 帶通： Ex和Em均為5 nm； 掃描速度： 1 200 nm·min-1； 響應時間： 儀器自動校正； 三維熒光光譜掃描范圍： Ex和Em均設置為200～600 nm。 在熒光發射光一側添加截止濾光片(290 nm)。

1.3 數據處理

利用熒光光譜軟件[FL WinLab software (Perkin Elmer)]進行實驗數據收集， Matlab R2013a軟件Removescatter工具包進行去散射處理， DOMFluor工具包進行平行因子分析， 運用殘差分析和對半分析進行模型檢驗， 繪制三維熒光圖譜。 參考文獻[6]， 通過Origin 2019b軟件， 計算熒光光譜指數： 熒光指數(fluorescence index,FI)、 生物指數(biological index,BIX)、 腐殖化指數(humification index,HIX)。 利用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性檢驗及相關性分析。

2 結果與討論

2.1 DOM熒光光譜指數

采用FI， BIX和HIX表征不同比例秸稈-牛糞發酵過程中DOM的來源特征和腐殖化程度， 見表2。 FI可反映腐殖質來源， BIX衡量自生源有機質在所測物質中的相對百分比大小， HIX表征有機質腐殖化程度[6]。 發酵至第40 d時， 4個處理FI介于1.722～1.936， 不同處理FI均大于1.4， 其中T1和T2小于1.9， 說明這兩個處理中DOM來源受自生源和外生源共同作用的影響， 既來自于秸稈-牛糞物料中自身的DOM， 亦有發酵過程中微生物分解物料新近產生。 T3和T4的FI均大于1.9， T3條件下表現更強的自生源特性， DOM更多來自于微生物的分解作用。 BIX變化范圍為0.842～0.905， 說明4個處理發酵至第40 d時， DOM均呈現較強的自生源特征(0.8

表2 DOM熒光光譜指數Table 2 Fluorescence spectrum indices of DOM

2.2 DOM熒光組分特征

采用平行因子法分析不同處理DOM的三維熒光光譜數據， 均得到3種熒光組分。 參考文獻[4,8,13-14]， 4個處理熒光組分和熒光峰類型結果見表3， 熒光組分的三維熒光光譜分布見圖1。

表3 不同處理的DOM熒光組分特征Table 3 Characteristics of DOM fluoresceocecomponents in different treatments

圖1 不同處理DOM三維熒光組分A峰： 紫外光區類富里酸； C峰： 可見光區類富里酸； T峰： 短波類色氨酸(類蛋白質)；T1峰： 長波類色氨酸； F峰： 類胡敏酸； B峰： 類酪氨酸(類蛋白質)Fig.1 Three dimensional fluorescence components of DOM in different treatmentsPeak A: fulvic acid in UV region; Peak C: fulvic acid in visible region; Peak T: short wave tryptophan (proteinoid);Peak T1: long wave tryptophan; Peak F: humicacid; Peak B: tyrosine (proteinoid)

4個處理中DOM的3個熒光組分相同。 其中組分C1包含2個激發峰和1個發射峰， 分別代表紫外光區類富里酸和可見光區類富里酸， 分別對應著A峰和C峰。 李帥東等[14]研究表明腐殖質化學結構中羧基和羥基與類富里酸含量有關。 A峰所代表的物質主要由相對分子質量較大、 生物可降解性較低的有機物產生， C峰所代表的物質主要源于相對分子質量較小的有機物， 這類物質一般生物可降解性較高， 具有良好的光化學性， 表現出較高的熒光效率， 易被氧化分解。 這兩類物質均屬于類腐殖酸， 常指示外源物質的輸入。

組分C2包含2個激發峰和1個發射峰， 均指示類色氨酸， 與羧基官能團有關， 分別對應指示短波類色氨酸的T峰和指示長波類色氨酸的T1峰。 張博等[15]研究表明在發酵過程中類色氨酸是微生物降解的溶解性代謝產物， 易與在同一蛋白質中結合的酪氨酸發生能量轉移， 對熒光峰具有復雜影響， 類色氨酸屬于類蛋白質組分。

組分C3包含2個激發峰和1個發射峰， 代表了類胡敏酸， 屬于腐殖質類物質， 對應F峰。 類胡敏酸分子量較大， 腐殖化程度較高， Nie等[16]研究中類胡敏酸含有多環芳烴和苯環， 且與木質素降解有關。

組分C4為類酪氨酸， 代表類蛋白質， 對應B峰。 Xu和Jiang[17]研究結果表明， 類酪氨酸與DOM中在微生物作用下降解的蛋白質類物質結構相關， 因其分子量小所以比類色氨酸更容易被降解。 C2和C4同屬于類蛋白質物質。

綜上所述， 以秸稈-牛糞為原料發酵過程中產生的熒光組分為： 類富里酸(紫外類富里酸、 可見類富里酸)、 類胡敏酸和類蛋白質(類色氨酸、 類酪氨酸)， 與Xu和Jiang[17]在有機物料發酵過程的熒光特性研究結果一致。

2.3 DOM熒光組分熒光強度

為分析發酵過程中DOM的熒光組分隨發酵時間變化規律， 對DOM不同組分的熒光強度和相對百分比進行分析。 如圖2， 隨發酵時間的延長， 不同處理類富里酸熒光強度呈增強趨勢， 熒光強度T1>T4>T3>T2； 類胡敏酸熒光強度呈增強趨勢， 熒光強度T3>T1>T2>T4； 類蛋白質熒光強度呈減弱趨勢， 熒光強度T1>T2>T3>T4。 總熒光強度(C1+C2+C3+C4)隨發酵時間先增加后減少， 最后趨于穩定。 最大總熒光強度出現在發酵第15 d， 此時T1>T3>T4>T2， 其中T1總熒光強度為(3 889.35±21.33) R.U.， T3總熒光強度為(3 733.59±57.30) R.U.。 Reader等[5]研究表明， 熒光強度的高低與發酵產物的結構和官能團相關， 類蛋白質因含有相對分子質量大的羧基、 羰基等電子基團， 熒光強度較低； 類腐殖質因含有氨基、 甲氧基、 羥基等電子基團， 熒光強度較高。 因此， 隨著秸稈比例的升高， 秸稈-牛糞腐殖化程度隨發酵時間的延長而增加， 隨著發酵溫度的升高， 發酵第15 d物料轉化速率最快， 發酵物料中的脂肪、 糖類、 蛋白質和碳水化合物等在微生物的作用下分解生成結構簡單、 相對分子質量小的線形芳香環腐殖質類有機物， 熒光強度較高； 類色氨酸和類酪氨酸等類蛋白質熒光強度較低， 其中T3中類胡敏酸熒光強度及相對百分比最大。 Gao等[9]研究結果表明， 熒光強度與DOM結構密切相關， 各熒光峰熒光強度可以間接揭示DOM含有的活性官能團及DOM性質， 所以本研究中第15 d樣品可作為熒光物質轉化的檢測點。

圖2 不同處理條件下的DOM各組分熒光強度和相對百分比Fig.2 Fluorescence intensity and relative percentage of DOM components in different treatments

3種熒光組分的相對百分比變化趨勢同熒光強度變化趨勢一致， 不同處理間類富里酸組分相對百分比T1>T4>T3>T2； 類胡敏酸的組分相對百分比T3>T1>T2>T4； 類蛋白質的組分相對百分比T3>T2>T4>T1。 隨著秸稈比例的升高， 熒光組分相對百分比類蛋白質>類富里酸>類胡敏酸。 D’Orazio等[18]研究表明， 木質素含有多糖、 脂肪類成分， 有利于腐殖化過程并使芳香結構成分增加， 發酵后， 牛糞中類蛋白物質腐殖化程度和芳香性均升高， 類富里酸含量顯著增加。 本研究與其結果完全一致， 玉米秸稈中含有大量的纖維物質(木質素、 纖維素)， 在發酵腐殖化過程中， 類蛋白質向類富里酸轉化， 進一步向類胡敏酸轉化， 類胡敏酸所占比例大小體現物料的發酵程度。 發酵處理中T3的類胡敏酸組分相對比例最高， 說明該處理發酵效果最好。

2.4 DOM熒光組分相關性分析

分析不同處理DOM的熒光組分相關性， 見表4， 當秸稈-牛糞比例為6∶4時， 類胡敏酸熒光強度值及相對百分比最大， 且類富里酸和類胡敏酸呈極顯著正相關(p<0.01)， 類富里酸和類胡敏酸均與類蛋白質呈負相關。 熒光強度大小及組分間的相關性反映出有機物料發酵過程中物質的轉化關系及方向， 為提高堆肥過程中秸稈利用率， 在確定合理的發酵物料配比時， 通過熒光組分的特性規律， 掌握一定的配比關系， 可為有機物料發酵生產有機肥提供一定的科學依據。 因此， 本研究秸稈-牛糞體積比為6∶4可作為生產實踐的參考。

表4 不同熒光組分間相關性Table 4 Correlations between differentfluorescence components

3 結 論

(1) 秸稈-牛糞發酵過程中DOM來源受自生源和外生源的共同影響， 因秸稈腐解時間較長， 40 d時有機質腐殖化程度尚較低； 秸稈-牛糞比例為6∶4時， 自生源特性較強， 且發酵末期腐殖化程度相對較高。

(2) DOM包含3種熒光組分： 類富里酸(紫外類富里酸和可見類富里酸)、 類胡敏酸、 類蛋白質(類色氨酸和類酪氨酸)。

(3) 隨發酵時間， 類富里酸和類胡敏酸熒光強度均增強， 類蛋白質熒光強度減弱； 其相對百分比和熒光強度變化趨勢一致。 總熒光強度隨發酵時間呈現先增加后減少， 最后趨于穩定的趨勢， 最大總熒光強度值出現在發酵第15 d。 隨著秸稈比例的升高， 熒光組分相對百分比： 類蛋白質>類富里酸>類胡敏酸。 類富里酸和類胡敏酸呈極顯著正相關， 兩者均與類蛋白質呈負相關。

(4) 秸稈-牛糞體積比為6∶4時， 類胡敏酸熒光強度及相對百分比最大， 可作為堆肥參考依據。