植物激素脫落酸分子的光譜與結構研究： 理論與實驗

張燕燕， 李冬賢， 馬劉正， 張 浩， 蘇 睿， 李林澤， 胡建東,3*

1. 河南農業大學機電工程學院， 河南 鄭州 450002 2. 河南省農業激光技術國際聯合實驗室， 河南 鄭州 450002 3. 小麥玉米作物學國家重點實驗室， 河南 鄭州 450002

引 言

植物激素是由植物在自身體內合成的一類微量有機物質[1]， 在植物體內某一部位產生， 再轉運到作用部位[2]， 在含量極低的情況下就能對植物的生長產生明顯的生理效應[3]。 脫落酸(abscisic acid， ABA)是天然的生長抑制素， 因能促進植物的葉子脫落而得名[4]， 具有調節植物氣孔關閉、 抑制種子萌發、 促進植物休眠等作用， 在農業生產中有極大的應用前景， 因此植物中ABA的痕量檢測對于構建植物激素測定的新思想新方法有著重要的意義[5]。 目前， 已經報道了多種ABA定量檢測的技術， 包括氣相色譜/質譜(GC/MS)[6]、 高效液相色譜/質譜(HPLC/MS)[7]、 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)[8]、 毛細管電泳[9]、 化學發光法[10]及局域表面等離子共振法(LSPR)[11]等。 這些方法由于其敏感性和選擇性較高可以檢測植物激素到超低水平， 但是它們通常耗時， 需要繁瑣的樣品預處理和富集。 因此， 在農業工程的研究上非常需求發展一個敏感， 快速， 簡單的植物激素測定方法， 而拉曼光譜技術因其靈敏度高、 樣品前處理快速簡單而廣泛應用于有機、 無機和小分子檢測中， 而利用拉曼光譜技術定量檢測ABA的研究還未見報道。

密度泛函理論(density functional theory， DFT)是通過電子密度來研究多種領域中電子結構的領先方法[12]， 利用DFT計算待測分子的分子軌道、 靜電勢、 電子躍遷能級可以為實驗研究提供分子層面的解析。 近年來， 利用DFT理論對分子的結構進行優化研究分子光譜性能的報道越來越多， 逯美紅等利用DFT對莧菜紅分子結構和SERS進行研究， 得到莧菜紅分子理論拉曼光譜的特征峰[13]； 何偉平等對頭孢氨芐的密度泛函進行研究， 進一步驗證頭孢氨芐的分子結構[14]； Dikmen利用DFT對3，5二甲氧基4羥基肉桂酸的Raman， SERS進行研究， 研究銀原子與分子結構的最佳結合位點， 為3，5二甲氧基4羥基肉桂酸的表面增強拉曼研究奠定理論基礎[15]。 目前， 利用DFT理論對植物激素ABA的光譜研究還未見到報道。

從理論和實驗兩個方面對ABA分子的光譜和結構進行了研究， 運用Gaussian09的B3LYP/6-31G(d，p)基組研究了ABA分子的Raman， SERS和IR； 運用Gaussian的NMR方法計算ABA的NMR譜； 將所得的理論計算光譜與實驗所得的譜學數據進行對比， 對分子結構進行了分析， 以保證計算得到的每一個穩定構型都對應勢能面上的一個局域最小點。

1 實驗部分

1.1 方法

實驗中所用的ABA樣品購自生工生物工程(上海)股份有限公司， 粉末狀， 分子式為C15H20O4， 分子量為264.32 g·mol-1。 取0.5 mg的ABA粉末放于硅片上， 由顯微共聚焦拉曼光譜儀(中國卓立漢光)測得ABA的拉曼光譜； 在120 ℃的條件下， 采用0.5 mL、 1%檸檬酸三鈉溶液還原50 mL、 0.01%的氯金酸溶液制得微粒尺寸60 nm的金溶膠， 金溶膠的SPR峰在530 cm-1。 各取10 μL 1 mmol·L-1的ABA溶液與60 nm的金溶膠混合， 取混合物10 μL滴在干凈的硅片上， 室溫晾干， 檢測其SERS光譜； ABA的紅外光譜由Nexus470智能型傅立葉變換紅外光譜儀(美國NICOLET)測量； 核磁共振光譜由400MR核磁共振波譜儀(美國安捷倫)測量。

1.2 計算方法

采用Gaussian09和GaussVeiw5.0軟件， 在DFT的 B3LYP/6-31G(d，p)基組水平上搭建分子結構優化并進行計算， 計算ABA的Raman和IR， 利用NMR的B3LYP/6-31+G(d)基組來計算NMR， 并將理論計算得到的Raman， IR， NMR與實驗所得的相應光譜進行對比。

2 結果與討論

2.1 脫落酸分子結構優化

ABA分子由有39個原子和146個電子組成， 基于DFT， 使用Gaussian 09將ABA分子優化至最低能級， 結構優化計算后， 分子構型的5個最小振動頻率值為： 24.83， 36.56， 39.19， 71.16和89.88， 它們對應的振動強度分別為1.538 4， 2.804 3， 2.534 0， 0.076 3和0.726 2， 說明優化后的分子無虛態， 分子結構穩定， 可以作為后續光譜分析的結構。 優化后的總能量為-884.54 eV， 偶極矩為1.435 3。 其優化后的分子結構如圖1所示。

圖1 脫落酸的分子結構Fig.1 The molecular structure of ABA

由圖1可以看出， ABA的分子結構主要由C2， C3， C4， C6， C7和C8組成的環狀結構和五個甲基C1-H20-H21-H22， C16-H30-H31-H32， C18-H34-H35-H36， C19-H37-H38-H39， C26-H40-H41-H42， 一個羰基C4-O5， 一個羧基C13-O14-O15-H29、 一個羥基O17-H33組成。

2.2 能級和分子軌道

Gaussian09計算了ABA分子能量最高的6個占據軌道和能量最低的6個空軌道能級， 為了更全面地觀察軌道電勢分布情況， 選擇對電子虛態的其中6個空軌道76—81軌道和電子占據的其中6個軌道70—75軌道計算電勢。 如圖2所示： 第75號分子軌道為HOME軌道，E75=-0.244 88 eV； 第76號分子軌道為LUME軌道，E76=-0.094 39 eV， 能隙ΔE=E76-E75=-0.150 49 eV， 能隙很小， 表明電子容易從HOME軌道躍遷到LUME軌道。

圖2 脫落酸的分子軌道能級圖Fig.2 Molecular orbital energy level diagram of ABA

圖3 脫落酸的分子軌道電子云分布圖Fig.3 Distribution of molecular orbital electron clouds of ABA

2.3 拉曼和表面增強拉曼光譜

如圖4所示， ABA的拉曼特征峰主要集中在600～1 700 cm-1之間， 這個區間內分子微運動方式主要是伸縮振動和搖擺振動， 在1 800～2 900 cm-1之間沒有特征峰。 計算的拉曼最強峰在1 689 cm-1， 實驗拉曼的最強峰在1 635 cm-1， 實驗SERS的最強峰在1 625 cm-1， 計算值較實驗測定的拉曼數值和SERS測定的數值大， 這是由于在高斯的計算模擬中將分子看做是單獨的， 不考慮分子之間相互作用的影響。 若高斯計算時取修正系數為0.97， 那么DFT計算所得的最強峰頻移為1 638 cm-1， 與實驗測的拉曼頻移1 635 cm-1相差3 cm-1， 差別較小， 說明計算的拉曼頻移與實驗測定的拉曼頻移吻合良好。

圖4 脫落酸的DFT計算、 拉曼實驗和SERS實驗對比Fig.4 The comparison of DFT calculation, Ramanand SERS experiment of ABA

對比DFT計算、 Raman和SERS實驗， ABA分子信號較強的拉曼峰有五個， 分別是1 635， 1 271， 1 048， 865和612 cm-1， 分別對應于ABA分子結構中碳碳雙鍵的伸縮振動、 碳碳單鍵的伸縮振動、 甲基的非平面擺動、 碳碳單鍵的外扭式振動及碳氫鍵的平面和非平面擺動， 說明ABA的拉曼特征峰主要來自于碳碳雙鍵和碳碳單鍵的振動， 其中碳碳雙鍵的伸縮振動引起的拉曼散射最強， 所以1 635 cm-1可以作為ABA的拉曼特征峰用于植物激素ABA的定性和定量檢測。

不同的拉曼頻移對應于分子中不同原子和基團的振動， ABA的拉曼頻移對應的振動模式如表1所示： 拉曼頻移小于1 100 cm-1所對應的分子振動模式以C—H鍵的非平面遙擺振動為主； 拉曼頻移在1 100～1 600 cm-1之間所對應的分子振動模式以C—C單鍵的非對稱伸縮為主； 拉曼頻移在1 600～1 800 cm-1之間所對應的分子振動模式以碳碳雙鍵的對稱伸縮為主； 拉曼頻移大于2 900 cm-1時所對應的分子振動模式以C—O和C—H單鍵的非對稱伸縮和非平面振動為主； 如： 拉曼頻移在1 053 cm-1所對應分子振動為： 五個甲基的非平面振動， 以及C6-H25， C6-H24， C9-H26， C12-H28和C3-H23的平面振動， 除了O原子以外， 幾乎所有的C—H都振動； 1 056 cm-1對應C10-C27的非平面振動， 四個甲基C16-H30-H31-H32， C1-H20-H21-H22， C19-H37-H381-H39， C18-H35-H36-H34的非平面振動， 但甲基C16-H30-H31-H32的振動最為劇烈； 1075對應甲基C16-H30-H31-H32的劇烈非平面振動， 其他四個甲基不動； 1 688 cm-1對應于C9-C10對稱伸縮振動和C11-C12的非對稱伸縮。 高斯計算后顯示： 凡是拉曼峰較強的位置都反映在分子結構的整體振動上， 幾乎沒有原子或基團是靜止不動的， 所以拉曼峰較強的位置都是幾個分子或基團相應振動疊加的結果。

表1 脫落酸的DFT， Raman， SERS特征峰及其歸屬Table 1 DFT， Raman and SERS characteristic peaks of ABA and their attribution

2.4 紅外光譜

紅外光譜反映的是分子的振動和轉動的加和表現， 不同分子的振動和轉動不同， 紅外光譜具有高度的特異性， 與拉曼光譜相互補充， 用于表征和鑒別各種化學物種。 圖5(a,b)分別為實驗檢測的ABA紅外光譜與計算得到的紅外光譜圖， 對比發現： 紅外光譜的實測結果和實驗結果吻合良好， 計算得到的紅外光譜可作為拉曼定量檢測的補充。

圖5 紅外吸收光譜(IR)(a): 實驗； (b): 計算Fig.5 Infrared absorption spectra of ABA(IR)(a): Experiment-IR spectrum; (b): DFT-IR spectrum

2.5 核磁共振譜

ABA分子結構中含有羥基和羧基， 在核磁共振檢測時羥基和羧基中的氫易發生不顯示的情況， 為了保證全部氫原子的相對位移都能確定， 檢測時， 各取兩份10 mg的ABA粉末分別溶于0.5 mL的甲醇和DMSO溶劑， 對比確定H原子的相對位移。 圖6為以DMSO為溶劑ABA的1H核磁共振譜， 對比甲醇溶劑的1H譜和DMSO中的1H譜發現， 甲醇溶劑的1H譜有19個H， 而DMSO溶劑的1H譜有20個H， DMSO溶劑的1H譜比甲醇溶劑的1H譜多了羥基上的氫。 其他位置氫相對位移的實驗與計算值如表2所示， 實驗與計算值最大相差1.052 ppm。

表2 脫落酸的1H-NMR相對位移Table 2 1H-NMR relative displacement of ABA

圖6 脫落酸的1H-NMRFig.6 1H-NMR of the ABA

圖7為ABA的13C核磁共振譜， 分子結構中不同位置C原子相對位移的實驗值與計算值如表3所示， 實驗與計算值最大相差13.785 ppm。 實驗與計算結果對比說明： 實驗結果與DFT計算結果較一致， 利用DFT計算ABA的核磁共振譜可以作為對ABA分子結構研究的補充和依據。

圖7 脫落酸的13C-NMRFig.7 13C-NMR of the ABA

表3 脫落酸的13C-NMR相對位移Table 3 13C-NMR relative displacement of ABA

3 結 論

基于密度泛函理論， 對ABA分子搭建分子結構并進行優化， 得到其穩定結構。 利用Gaussian09的B3LYP/6-31G(d， p)基組和NMR方法， 計算ABA分子的常規Raman光譜、 IR及NMR譜。 在此基礎上， 實驗驗證了ABA的Raman、 SERS、 IR及NMR譜， 最后將計算譜圖與實驗結果進行對比及振動譜指認歸屬。 結果說明： 理論計算結果與實驗研究結果吻合良好， ABA分子拉曼峰較強的位置都反映在分子結構的整體運動上， 幾乎沒有原子或基團是靜止不動的， 拉曼峰較強的位置都是幾個原子或基團相應振動疊加的結果， 信號最強的特征峰在1 635 cm-1， 主要來自于碳碳雙鍵的劇烈伸縮振動和碳碳單鍵的伸縮振動， 1 635 cm-1可以作為拉曼特征峰用于ABA的定性和定量檢測。 這些工作將為光譜技術在植物激素檢測中的發展和應用提供一定的實驗參考和理論支撐， 對后期植物激素ABA的定量檢測研究提供可靠的理論基礎。