激光誘導熒光光譜快速檢測食源性致病菌

劉 宇， 李增威， 鄧志鵬， 張慶賢*， 鄒立扣*

1. 成都理工大學， 地學核技術四川省重點實驗室， 四川 成都 610059 2. 四川農業大學資源學院， 四川 成都 611130

引 言

隨著生活水平不斷提高， 人們對食品安全越來越重視， 從而暴露出各種食品污染問題， 其中， 食源性微生物污染的問題與人們的生活息息相關。 微生物檢測技術是保證食品安全的基礎技術， 其核心在于高效、 快速地檢測微生物。 我國常用的傳統微生物檢測技術主要是顯微鏡檢測法和平板培養法， 它在一段時間內為我國的微生物檢測實踐提供了豐富的經驗， 但其效率低下、 流程冗長， 無法滿足快速發展的食品安全檢測需求， 因此相繼提出各種微生物快速檢測技術。 3M公司和RCP Scientific Inc公司提出即用紙片法， 可檢測大腸桿菌(Escherichiacoli)等常見菌種的計數及菌落總數， 此法大大提升了工作效率， 但實驗成本較高。 隨著色譜和光譜檢測技術被應用于微生物檢測， Kim等利用流式細胞術(FCM)， 高效、 快速地鑒定了球芽孢桿菌(Bacillusglobigii)、 大腸桿菌(E.coli)和草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)[1]； 高雯瑄等研究總結了PCR技術在沙門氏菌(Salmonella)、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等六種食源性致病菌的定量檢測應用[2]。 這些高效的檢測技術具有良好的重復性和準確性， 但儀器和實驗操作對研究者的要求較高。 從光譜化學分析的角度， Shelly等通過熒光譜鑒定了生長介質中的假單胞菌[3]； Giana等基于410和430 nm激光激發的熒光光譜分析， 研究了糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、 大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的檢測方法[4]； Arabia等利用266和405 nm激光， 獲得液相細菌光譜指紋圖譜， 識別了金黃色葡萄球菌(S.aureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[5]； Bhatta等通過乳桿菌(Lactobacillus)、 酵母菌(Saccharomyces)的熒光光譜研究了它們的特性[6]。 這些研究顯示了激光誘導熒光(laser-induced fluorescence spectrometry， LIFS)應用在細菌菌株識別和定量技術的潛力， LIFS是一種快速、 簡單又經濟有效的快速識別細菌方法。

論文提出利用熒光光譜特征對不同的細菌樣品進行快速識別和表征， 以405 nm激光作為激發光源， 搭建了一套激光誘導熒光光譜的檢測系統， 以三種常見致病細菌為樣本(一種革蘭陽性菌糞腸球菌(E.faecalis)， 兩種革蘭陰性菌包括鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa))， 對三種細菌的菌液樣本進行熒光激發， 分析了三種細菌樣本的熒光光譜特性差異。 對糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的熒光光譜分段處理， 提取9個特征量， 用于動態聚類算法(dynamic clustering algorithm,DC)識別， 實現了對糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 測量原理

根據分子熒光效應和光譜分析原理[7]， 當光致分子受到紫外光照射， 熒光基團吸收能量， 輻射出頻率更低的熒光， 每種物質因其獨一無二的結構， 熒光效應都有其特定吸收波長和發射波長， 表現出不同的熒光光譜特性。

細菌中含有各種具有固有熒光基團的生物分子[8]， 由于熒光基團含量、 細菌結構或者理化成分存在差異， 不同細菌在激光誘導下產生的熒光光譜有所差別， 可根據熒光特性進行細菌的分類識別。

1.2 系統與參數

實驗系統由405 nm激光模塊、 熒光探頭模塊、 熒光光譜采集模塊、 控制模塊、 控制和能譜處理軟件模塊組成[9]， 如圖1所示。

圖1 便捷式405 nm激光誘導熒光檢測儀系統結構圖Fig.1 Structure of portable 405 nm laser-inducedfluorescence detector

工作時， 激光器光源發射出405 nm激光， 經熒光探頭用聚焦透鏡將激發光聚焦到待激發樣品， 激光能量激發熒光分子， 進而發生能級躍遷并發出熒光， 利用同一聚焦透鏡同時收集熒光。 探頭內置405 nm濾光片組， 將反射回來的激發光濾除并保留熒光信號， 由光譜儀采集熒光信號并由軟件進行處理。 其中， 激光器與光譜儀的參數列在表1、 表2。

表1 激光器參數Table 1 Parameters of the laser

表2 光譜儀性能參數Table 2 Parameters of the spectrometer

1.3 試劑耗材

實驗材料由四川農業大學應用微生物學實驗室(四川， 成都)提供， 包括細菌菌株(糞腸球菌、 鼠傷寒沙門氏菌、 銅綠假單胞菌)， TSA培養基， TSB培養基， 氯化鈉(分析純)， 50 mL離心管， 超純水等。

1.4 細菌培養

用接種環將甘油管中的菌株在TSA平板上劃線， 37 ℃下培養20 h； 用接種環挑取TSA平板上的單菌落接種到50 mL TSB培養基中， 37 ℃振蕩培養20 h； 培養完成后將菌液3 000 r·min-1離心10 min， 倒去培養基。 用30 mL 0.9%生理鹽水洗滌細菌， 離心倒去生理鹽水， 重復三次， 以充分洗去TSB培養基的殘留。 最后用0.9%生理鹽水制成細菌懸液， 并在600 nm處調節菌液濃度為1.5OD。 為了避免雜菌污染， 整個過程在超凈工作臺完成。

1.5 測定

將裝有細菌懸液的試管充分震蕩后， 用移液槍在試管中部吸取3 mL菌液轉移到石英比色皿(容量為4 mL)， 蓋上比色皿蓋子防止細菌污染儀器。 為了避免其他光源的影響， 將比色皿的光面垂直激光發射方向放置到暗室， 利用405 nm激光誘導熒光檢測系統對菌液樣本進行熒光激發與采集， 如圖2所示。

圖2 儀器與操作流程圖Fig.2 The instrument and operation flow chart

2 結果與討論

2.1 激光器功率驗證

在單位時間內， 激光器功率越高， 代表的激光器輸出能量越高， 對一些深色物質容易因為能量太高而被“燒焦”， 而一些弱熒光信號的物質需要更高的功率激發熒光信號[7]， 設置合適的激光器功率對采集的熒光信號至關重要。 選用鼠傷寒沙門氏菌菌液樣本驗證分析熒光光譜強度(Intensity)與激光器功率(Power)的關系。 根據圖3(b)發現， 隨著激光器功率上升， 細菌的熒光強度隨之上升。 在功率10～100 mW范圍內， 細菌樣本的熒光強度與激光器功率呈良好的線性關系， 擬合優度R2=0.997。

圖3 P=10～100 mW， c=1.5OD， 糞腸球菌的熒光譜圖(a)； 熒光強度與功率的線性關系圖(b)Fig.3 P=10～100 mW， c=1.5OD， the fluorescence spectra of E.faecalis (a); and Relationship between Intensity and Power (b)

為了避免功率過低光譜噪聲大、 功率過高引起“燒灼”， 影響細菌的熒光效果， 建議選用50～80 mW的激光器功率， 本實驗采用50 mW。

2.2 光譜分析

在P=50 mW，λ=405 nm激光下誘導熒光， 光譜儀將采集到的熒光光譜進行平滑和峰值歸一化處理， 光譜范圍設置為400～800 nm， 得到如圖4所示的熒光光譜圖， 細菌樣本的峰值特征在表3列出。

圖4 細菌樣本的熒光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of bacteria samples

表3 P=50 mW， λ=405 nm時， 細菌樣本的 峰值波長和相對強度Table 3 P=50 mW,λ=405 nm, peak wavelengthand relative intensity of bacteria samples

實驗發現， 鼠傷寒沙門氏菌、 糞腸球菌和銅綠假單胞菌顯示出獨特的熒光光譜。 細菌具有的熒光基團大致相同， 主要由卟啉(Porphyrin)、 輔酶(Coenzyme)、 NADH(NADPH)和黃素(Flavins)等組成[8]， 但熒光基團含量、 細菌生物體結構以及不同細菌吸收激光能量的程度都存在差異， 形成了獨特的細菌熒光譜圖。 同為革蘭陰性菌， 鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌發射出的熒光在515 nm附近， 此外， 銅綠假單胞菌的熒光光譜還分別在634和703 nm顯示出熒光峰， 且634 nm處熒光峰峰值對應光譜峰值最大值， 而革蘭陽性菌糞腸球菌的光譜在530 nm才出現熒光峰。 資料表明革蘭陽性菌細胞壁較厚(約20～80 nm)， 肽聚糖是其主要成分， 而革蘭陰性菌細胞較薄(約10 nm)， 除了肽聚糖， 還包含其他復雜成分， 如脂多糖、 脂蛋白等[10]。 前人的研究表明不同熒光基團對應特定的熒光峰， 如表4所示。 溶劑生理鹽水(NS)的熒光峰出現在λ=467 nm， 對應—OH熒光基團[11]； Koenig等研究指出， 黃酮類發出綠色熒光(530 nm)[8]， 由此認為糞腸球菌在528 nm附近的熒光峰可能對應著黃酮類基團的熒光發射， 而銅綠假單胞菌在634 nm的熒光峰則可能對應著原卟啉基團的熒光響應(633 nm)。

表4 具有較高熒光量子效率的熒光基團及其最大吸收和發射波長[12]

2.3 細菌識別

實驗發現， 利用P=50 mW，λ=405 nm的激光， 誘導出銅綠假單胞菌的熒光峰， 分別在634和707 nm處產生異于其他兩種細菌的熒光峰， 顯示出較強的獨特性， 根據該熒光特性， 可以直接實現對銅綠假單胞菌的特異性識別。 糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的熒光光譜圖除本底熒光峰， 僅包含一個較寬的熒光峰， 峰位也大致相同， 無法直接進行識別， 但細菌熒光峰與溶劑熒光峰的相對強度比和熒光峰上升、 下降的梯度都存在區別， 考慮兩種差異， 論文基于多元分析方法， 提出LIFS結合動態聚類的方法識別細菌種類， 具體實驗操作步驟為： 分別配置濃度為1.5OD的糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌液樣本各60組， 在P=50 mW，λ=405 nm激光條件下進行激發熒光， 獲得熒光光譜120組； 如圖5所示， 對459～586 nm之間光譜劃分為9個特征區域， 以a1(溶劑的熒光峰)作為標準進行標準化處理得到9個特征量(Characteristic value)， 由此得到120組包含9個特征量的標準化數據(聚點， Point)， 見表5， 隨機將120組聚點按照7∶3的比例分為訓練集和測試集。

圖5 劃分特征區域Fig.5 Division of characteristic areas

表5 特征區域和特征量Table 5 Characteristic areas and values

實驗中， 在訓練集中隨機選取兩組聚點作為初始聚點； 分別計算其他聚點與初始標準聚點的歐氏距離[式(1)]； 按照最短距離原則， 將距離最近的聚點與初始標準聚點合并(對特征量求平均值)作為二代標準聚點； 重復如上步驟， 直到進行完全聚類， 得到最終的標準聚點[圖6(a)]。 將測試集的樣本聚點與標準聚點按照最短距離進行聚類判斷[圖6(b)]， 實現對未知細菌的識別， 得到識別結果(表6)。

表6 動態聚類對糞腸球菌、 鼠傷寒沙門氏菌的識別率Table 6 Correct recognition rate of E.faecalisand S. Typhimurium by DC

圖6 訓練集標準聚點(a)、 測試集樣本聚點(b)Fig.6 The standard cluster point of training set (a),sample cluster points of test set (b)

式(1)中， xk為標準聚點的特征量的值， k=1∶9； yk為測試集的特征量的值。

對測試集數據進行識別， 糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的識別率皆為100%， 無識別錯誤和未識別數據， 說明LIFS結合動態聚類分析對三種常見食源性致病菌快速檢測的可行性。 本研究方法檢測費用較低， 無需大量的生化實驗準備及耗材[1-2]， 儀器成本較低； 識別速度快， 銅綠假單胞菌實現了即時識別， 糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌數據處理耗時10 min左右， 優于FCM法(約3 d)[1]、 PCR反應體系(2 d)[2]等； 同時， 三種細菌都實現了100%識別， 該法識別率高。

利用便捷式405 nm激光誘導熒光檢測系統實現了對三種常見食源性致病菌的無接觸檢測， 檢測速度快， 識別效率高， 但目前所做的工作僅限于對樣品熒光光譜特征進行研究， 沒有討論微生物在培養、 制樣及照射過程中涉及的生物化學變化等， 這些將值得更深入的分析討論。

3 結 論

利用便捷式405 nm激光誘導熒光檢測系統， 對糞腸球菌、 鼠傷寒沙門氏菌、 銅綠假單胞菌等常見食品污染致病菌誘導熒光， 發現三種細菌的熒光光譜各有差異。 簡單驗證了激光器功率與細菌熒光強度的關系， 得出最佳激光器功率范圍為50～80 mW。 在P=50 mW，λ=405 nm激光誘導下， 銅綠假單胞菌的熒光光譜在λ=634 nm和λ=703 nm產生有別于其他兩種細菌的熒光峰， 可以據此對銅綠假單胞菌進行直接識別。 基于動態聚類的思想， 采集糞腸球菌， 鼠傷寒沙門氏菌120組熒光數據并隨機分為訓練集84組、 測試集36組， 對熒光譜圖劃分9個特征區域進行特征量聚類識別， 得出糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的識別率為100%， 實現對糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的快速識別。 經實驗驗證， 激光誘導熒光光譜法操作簡單， 檢測速度快， 效率高， 結合動態聚類的思想， 為實際微生物快速檢測討論設計了一種新的測試方法。