雞CEBPA基因CDS區克隆、表達及生物信息學分析

杜振偉 朱帥鵬 馬向飛 李東華 孫桂榮

（河南農業大學動物科技學院，鄭州 540046）

CEBPA是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個亞家族成員中最早發現的［1-2］.，該增強子結合蛋白家族在脂肪細胞生長、分化、骨髓組織細胞生成及機體免疫過程中發揮重要作用［3］，同時在脂肪的生長過程中起正向調和反向調節作用。CEBPA被認為是調節脂肪形成的關鍵分子之一［4-5］，在脂肪細胞的終末分化中有著很重要的作用［6］。牙髓衍生的間充質干細胞（DPSc）沿成骨和成軟骨途徑分化時，因DPSc不含脂泡，檢測到CEPPA的表達水平降低［7］。在特發性肺纖維化（IPF）細胞中過表達CEBPA可增加脂肪生成潛能和脂肪成纖維細胞標記物的表達，抑制CEBPA的表達會降低了成脂潛能并促進了成纖維細胞的活化［8］。全反式維甲酸（atRA）可通過RARG-FRA1-PPARG2或CEBPA軸或兩者抑制骨髓間充質干細胞（BMSC）的脂肪形成［9］。白藜蘆醇通過使PPARG、CEBPA、FABP4和LMO3的表達下調來抑制脂肪分化［10］。CEBPA增強了Slc2a4基因和GLUT4蛋白的表達，是脂肪細胞分化的標志［11］。Gao等［12］研究表明CEBPA 的啟動子區 CpG 位點甲基化使瘦肉系雞顯著高于脂肪系雞，且啟動子區域-1 494 bp - -1 478 bp 的 CpG CEBPA mRNA 表達呈顯著負相關，這就表明該基因在脂肪組織中發生甲基化并調控脂肪發育。CEBPA與脂肪分解、脂肪生成和脂肪酸飽和相關基因聚在一起［13］，同時秦川牛的脂肪沉積也與CEBPA有關［14］。本實驗通過對CEBPA基因編碼序列進行生物信息學分析，并測得其在不同組織，不同發育時期及不同品種的表達量且加以分析，為以后CEBPA基因在胸肌脂肪沉積方面的研究提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗的試驗對象為固始雞和羅斯雞，均由河南農業大學家禽種質資源場提供。分別取6、12、22、30、55周齡的健康固始雞各3只和6周齡羅斯雞3只，置于相同的環境下飼養一段時間后，進行頸部放血法處死試驗動物后，迅速采集胸肌、肝臟、腿肌、皮下脂肪，腹脂組織并及時用液氮進行冷凍，并置于-80℃保存備用。本研究通過河南農業大學科學倫理委員會批準（批準號20-0086）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉錄 使用TRIzol法提取固始雞胸肌、肝臟、腿肌、皮下脂肪，腹脂以及羅斯肉雞胸肌的總RNA，并用反轉錄試劑盒制備cDNA，放入-20℃冰箱保存以備后用。

1.2.2 雞CEBPA CDS區的克隆 根據NCBI上雞（NP_001026630.1）的CEBPA基因的CDS區，在Oligo 7上設計克隆引物見表1，以肝臟的cDNA模板。PCR反應體系：cDNA 4 μL，上、下游引物各 6 μL，KOD OneTMPCRMaster Mix 100 μL，加水至200 μL。PCR反應條件：98℃ 3 min；98℃ 10 s，70℃ 5 s，68℃ 15 s，15個循環；98℃ 10 s，55℃ 5 s，68℃ 15 s，25個循環；68℃ 10 min。反應結束后，為DNA平末端加A尾，再向PCR產物中添加約體系1/3的 2×Rapid Taq Master Mix，震蕩混勻，再放入PCR儀中，72℃ 10 min。反應結束后，將PCR擴增產物進行1.5%瓊脂凝膠電泳檢測，并將目的片段進行切膠回收，用回收產物與pMDTM18-T Vector Cloning Kit連接，16℃ 16 h后轉化DH5α感受態細胞，涂板，37℃培養，挑選陽性菌落，經菌液PCR鑒定，送上海生工生物公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用TMHMM和SignalP 5.0在線軟件分析其跨膜結構域與信號肽；運用PSIPRED和 SWISS-MODE在線軟件對其蛋白的二級，三級結構進行預測；利用PSORT II Prediction在線軟件對蛋白進行亞細胞定位；用DNAStar軟件對雞（NP_001026630.1）、小鼠（NP_001274443.1）、人（NP_001272758.1）、豬（XP_003127063.1）、牛（NP_789741.2）、家兔（XP_008255494.1）、日本鵪鶉（XP_015729433.1），斑馬魚（NP_571960.1）的氨基酸序列進行同源性分析；用 MEGA 7.0 軟件構建CEBPA蛋白物種進化樹。并用STRTNG進行蛋白互作分析，相關參數設置為：最小相關得分為0.40，一級最大相關因子數為10。在NCBI網站中搜索雞CEBPA基因的核苷酸序列，以其轉錄起始位點為界限，截取基因序列上游-2 000 bp - -1 bp共2 000 bp序列作為CEBPA基因5'調控區進行序列分析，并利用在線軟件BDGP：Neural Network Promoter Prediction，Promoter 2.0和FPROM對 雞CEBPA基因5'調控區的啟動子進行預測和分析，同時用在線軟件EMBOSS和MethPrimer對其啟動子區進行甲基化CpG島預測，相關參數設置為：CpG島長度＞200 bp，CpG檢測含量/期望含量（Obs/Exp）＞0.60，GC%＞50%。

1.2.4 熒光定量PCR 該反應以得到的cDNA為模板，采用SYBR GreenⅠ染料法和LightCycler96實時熒光定量PCR儀，按照試劑盒中的操作說明，以β-action作為內參基因，檢測目的基因的表達量。qRT-PCR反應體系為10 μL，其中TBGreen Mix 5 μL，無RNA酶水 3 μL，上、下游引物（表1）各0.5 μL，cDNA 1 μL。qRT-PCR擴增反應程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環；95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；37℃ 30 s。每組實驗包含2個技術重復和6個生物重復。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequences

1.2.5 實時定量數據分析 采用SPSS 23.0軟件單因素分析方法，利用Duncan法進行差異顯著性檢驗。P＜0.01表示差異具有極顯著性，P＜0.05表示差異具有顯著性。數值表示為平均數±標準差，利用GraphPad Prism5.0軟件作圖。

2 結果

2.1 雞CEBPA CDS區的克隆

以雞肝臟的cDNA為模板，通過PCR擴增用瓊脂凝膠電泳檢測目的片段以及陽性菌落測序（圖1）。該片段為CEBPA基因的CDS區的全長（GenBank登錄號：NC_006098.5），975 bp，共編碼氨基酸325個，位于Chromosome 11：10295396-10296370，一個外顯子。

2.2 雞CEBPA的生物信息學分析

2.2.1 CEBPA蛋白結構和功能的預測 預測CEBPA蛋白結構表明，該蛋白不存在跨膜域，且無信號肽（圖2-A，2-B），有211個氨基酸組成的無規則卷曲序列，占整個序列的65.12%，是CEBPA蛋白的重要組成部分，有113個氨基酸構成了α-螺旋占全部結構的34.88%，與在線預測的蛋白三級結構的結果基本相似（圖2-C，2-D）。同時預測得知雞CEBPA蛋白主要在細胞核中占60.9%，一部分還分布在細胞質中占21.7%。運用STRTNG顯示該蛋白與Runx轉錄因子家族、TRBs家族、PPARs核受體超級家族等有相互作用的關系，結果見圖2-E。

2.2.2 CEBPA氨基酸序列的同源性分析 為了研究該基因的生物進化進程，對不同物種CEBPA的氨基酸序列進行同源性分析。結果表明，雞與鵪鶉、人、豬、牛、兔、小鼠、斑馬魚的同源性分別為99.4%、93.9%、83.5%、85.3%、82.7%、83.3%、74.8%（圖3-A）。并用這8個物種的CEBPA氨基酸序列構建系統進化樹（圖3-B），發現雞與鵪鶉的親緣關系最近，雞與人和小鼠的親緣關系最遠。

2.2.3 CEBPA啟動子和CpG島的預測 在NCBI數據庫獲得雞CEBPA 5'調控區-2 000 bp序列，在染色體上的位點為：Chromosome 11：10293396-10295395。并將這-2 000 bp作為候選啟動子區用3種啟動子預測軟件進行預測分析，BDGP：Neural Network Promoter Prediction預測雞CEBPA有7個啟動子，Promoter 2.0預測雞CEBPA有2個啟動子，FPROM預測雞CEBPA有4個啟動子（圖4-A）。使用EMBOSS和MethPrimer對雞CEBPA 5'調控區-2 000 bp序列進行CpG島預測，結果（圖4-BC）兩個預測軟件結果完全一樣，CpG島位于CEBPA 5'調控區-2 000 bp序列的-265 bp - -1 895 bp之間，大小為1 640 bp。

圖 1 雞 CEBPA CDS 區克隆結果Fig.1 Cloning results of chicken CEBPA CDS region

2.3 雞CEBPA在固始雞時空表達譜的構建

本試驗利用qRT-PCR方法構建12周齡固始雞CEBPA的組織表達譜（圖5-A）。結果表明，CEBPA胸肌和腿肌的表達量顯著低于腹脂、皮下脂肪、肝臟的表達量（P＜0.05）。利用qRT-PCR方法測量的6周齡、12周齡、22周齡、30周齡、55周齡固始雞胸肌中CEBPA的表達量，構建時序表達圖譜（圖5-B）。結果表明，CEBPA在6周齡到55周齡的相對表達量呈U型，6周齡到22周齡CEBPA的相對表達量逐漸降低，22周齡到55周齡CEBPA的相對表達量逐漸增高。在22周齡時，相對表達量最低，且顯著低于6周齡和55周齡（P＜0.05）。

2.4 CEBPA在固始雞和羅斯肉雞胸肌中表達譜的構建

通過對6周齡的羅斯雞（LS）和固始雞（GS）胸肌中CEBPA的表達量的測定，發現羅斯肉雞中的相對表達量顯著高于固始雞（P＜0.05），大約為2.5倍，結果見圖6。

圖 2 CEBPA 蛋白結構和功能的預測Fig.2 Prediction of CEBPA protein structure and function

3 討論

傳統的生物學認為，蛋白質的序列決定了它的功能［15］。因此我們預測雞CEBPA蛋白的結構和功能，表明該蛋白不存在跨膜域、無信號肽，不是分泌蛋白。結構域是蛋白質中具有特異空間結構和獨立功能的區域，能夠決定蛋白質發揮關鍵的生物學效用［16］。秦川牛脂肪沉積基因CEBPA的兩種蛋白亞型都定位在細胞核中［14］，與雞CEBPA蛋白預測的結果不同，雞CEBPA蛋白有21.7%存在于細胞質中，這為后續研究CEBPA在脂肪沉積中功能提供了理論基礎。

PPI網絡圖中顯示CEBPA蛋白多個家族存在互作作用，PPARG是一種依賴于配體激活的轉錄因子。PPARG、PPRα和PPARβ一起組成核受體超級家族，PPARs主要調節糖代謝和脂肪分布［17］；HNF4A是肝細胞核因子（heptocytenuclear、HNF）家族的一員。在肝臟中表達量較高的一類轉錄因子，調節肝臟基因的特異性表達。HNF4A主要調控葡萄糖、氨基酸和脂質的代謝［18-19］；TRBs家族有TRIB1、TRIB2和TRIB3，擁有類似激酶結構，卻缺乏激酶的催化活性。其主要通過與靶蛋白結合，調節靶蛋白的功能的促進或抑制或蛋白穩定性［20］。TRIB2在人類急性髓系白血病表達增高，可抑制CEBPA的功能進而促進白血病的進展［21］。

圖 3 CEBPA 氨基酸序列保守性分析Fig.3 Conserved amino acid sequence analysis of CEBPA

圖 4 CEBPA 啟動子和CpG 島預測結構示意圖Fig.4 Schematic diagram of the predicted structure of CEBPA promoter and CpG island

圖 5 CEBPA 在固始雞中的時空表達譜Fig.5 Spatial and temporal expression profiles of CEBPA in Gushi chickens

圖 6 CEBPA 在 6 周齡固始雞和羅斯雞胸肌中的相對表達量比較Fig. 6 Comparison of the relative expression of CEBPA in the pectoral muscle of 6-week-old Gushi and Rose chickens

C/EBP通過結合抑制干細胞更新的基因以及激活髓樣分化基因的啟動子來誘導骨髓祖細胞的粒細胞分化和維持成人造血干細胞（HSC）靜止［22-24］。人類已知的大多數CEBPA啟動子在肝細胞或脂肪細胞中表達調控［25］，因此我們利用在線軟件預測雞CEBPA基因5'調控區-2 000 bp序列的啟動子，NNPP預測得到7個啟動子，其中有兩個啟動子的分值在0.9以上。FPROM預測得到的4個啟動子中只有一個有TATA盒。而Promoter2.0預測得到的2個啟動子可信度都是臨界性預測，且分值都在0.9以下，假陽性的可能性較大，為后來研究CEBPA的激活對脂肪沉積提供基礎的信息；CpG島主要位于基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60%以上基因的啟動子含有CpG島。而人類的基因組中，約80%的CpG二核苷酸是甲基化的，常位于基因啟動子區域的CpG二核苷酸是未甲基化的［26］。DNA的甲基化具有穩定性，可阻止轉錄因子的結合，從而調控基因的低表達或不表達［27］。在乳腺癌發病過程中，CEBPA的甲基化通過阻斷CEBPA與精氨酸甲基化轉移酶1（PRMT1）抑制因子HDAC3結合，促進細胞周期蛋白D1的表達，導致腫瘤細胞快速生長［28］。抑制組蛋白賴氨酸去甲基化酶7A（KDM7A）使CEBPA和分泌型卷曲相關蛋白1（Sfrp1）的表達下降，從而抑制了細胞的成脂分化，促進了成骨分化［29］。因此預測CEBPA的CpG島，為后續研究提供了基礎的資料。

基因在同一種生物不同器官組織中存在表達廣泛性和特異性［30］，基因在組織中的表達受多種因素調控，不同組織的功能不同，導致同一基因在不同組織中的表達也有所不同［31］。前人實驗證實CEBPA是維持造血系統粒系分化過程中的重要的轉錄因子，在調節細胞增殖與分化的平衡中也起著關鍵作 用［32-34］。CEBPA是第一個在脂肪細胞分化中發揮重要作用的轉錄因子。它在大多數特異性脂肪細胞基因轉錄之前就已經得以表達，此外許多特異性脂肪細胞基因的最近端啟動子上都含有CEBPA結合點。Wang等［13］在小鼠體內干擾了CEBPA，小鼠表現出白色脂肪組織發育停滯現象。本試驗通過構建固始雞不同組織表達譜可以發現，皮下脂肪、腹脂、肝臟中CEBPA的相對表達量較高，且差異不顯著。因肝臟是產生脂肪的主要組織，由此可見肝臟中CEBPA相對表達量較高可能與肝臟的功能有關。同時腹脂與皮脂都是產生脂肪的組織，因此推測CEBPA對家禽體內脂肪的形成有重要作用。

本研究測定6周齡的羅斯雞與固始雞胸肌中CEBPA的表達量，發現羅斯雞的表達量遠遠高于固始雞中的表達量。經查資料可知，羅斯雞為肉雞，體內脂肪含量多，且生長快，飼料報酬高［35］。而固始雞為蛋雞，胸肌內的脂肪含量少。CEBPA與脂肪的合成有關，因此在羅斯雞的表達量高與脂肪含量含量多有關。同時本研究還測得了固始雞胸肌不同發育時期CEBPA的表達量，結果呈U型。在22周齡時表達最低，55周齡表達量最高。另課題組測得的6周齡、12周齡、22周齡、30周齡固始雞胸肌的脂肪含量與CEBPA表達的趨勢一致［36］，還測得55周齡與20周齡相比胸肌的脂肪含量明顯增加，也與CEBPA表達趨勢相同。22周齡時固始雞進入產蛋期，55周齡時已經經歷了產蛋高峰期，進入衰老期，將要被淘汰［37］。產蛋期的雞體內激素分泌旺盛，代謝能力增強［38］，因此在產蛋期雞體內的脂肪含量會有所變化。但隨著雞的年齡日漸增大，產蛋高峰期也逐漸過去［39］，雞體內的脂肪沉積會越來越多，所以推測此時期CEBPA基因對胸肌中脂肪沉積發揮著較大功能。

4 結論

本研究克隆了雞CEBPA CDS區的全長序列（Genebank登錄號：NC_006098.5），全長為975 bp，一個外顯子。生物信息學分析表明，該蛋白在物種間的保守性高，不是分泌蛋白，定位于細胞核與細胞質中；該蛋白還與Runx轉錄因子家族、TRBs家族、PPARs核受體超級家族等多個家族相互作用；3種在線軟件預測CEBPA 5'調控區-2 000 bp序列上共有13個啟動子；預測該區域共有一個CpG島且位于CEBPA 5'調控區-2 000 bp序列的-265 bp - -1 895 bp之間，大小為1 640 bp；qRT-PCR結果表明，CEBPA在胸肌和腿肌的表達量顯著低于腹脂、皮下脂肪、肝臟的表達量；固始雞胸肌中CEBPA的表達量在6周齡、12周齡、22周齡、30周齡、55周齡成U型結構，22周齡的表達量相對于6周齡和55周齡表達量顯著降低；6周齡固始胸肌的表達量顯著低于羅斯肉雞的表達量。CEBPA可能參與調控胸肌的脂質沉積。