芽孢桿菌LM基于全基因組的分類鑒定及抑菌原理的 研究

蔡國磊 陸小凱 婁水珠 楊海英 杜剛

（1. 云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，昆明 650500；2. 云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650500）

泡菜中常見的乳酸細菌有植物乳桿菌、短乳桿菌和腸膜明串珠菌等菌類比較豐富。在本研究從泡菜中分離得到了一株具有抗黑曲霉活性的解淀粉芽孢桿菌。芽孢桿菌為一種極具生防價值的菌種，有的研究有利用菌株 FZB24 和 B9601-Y2 開發(fā)的生物制劑對鐮刀菌和絲核菌引起的根腐病和枯萎病［1-2］。芽孢桿菌合成的抗菌物質(zhì)主要分為兩類，一類是分子量300-3 000 kD的非核糖體合成的抗生素，多數(shù)為 iturin、surfactin、fengycin 等環(huán)形脂肽，少數(shù)是氨基糖苷；另一類是核糖體合成的細菌素、幾丁質(zhì)酶等蛋白類抗生素［3-4］。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）最早由 Priest等［5］發(fā)現(xiàn)并鑒定，解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）是有典型特征的芽孢桿菌，它的細胞呈直桿狀，為革蘭氏陽性菌株能合成脂肽類、肽類、磷脂類等物質(zhì)［6］。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）以及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)生的脂肽類抗生素有表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturins）和芬薺素（fengycin）三大類［7］。表面活性素最初鑒定和命名由Arima等完成［8］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由Kakinuma等確定［4］，iturins 和fengycins 類抗生素對多種植物病原真菌具有較強的拮抗活性surfactin 雖然自身對真菌沒有明顯的抑菌活性，但surfactin 可增強 iturins 或fengycins 的抑菌活性［9］。解淀粉芽孢桿菌的具有抗菌及植物互作等方面的作用［2，10］，在生物防治和醫(yī)學(xué)中具有潛在應(yīng)用價值。

在菌株的分類鑒定中，有些微生物親緣關(guān)系較近，16S rRNA 序列相似度太高無法進行有效的區(qū)分［11］。隨著二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的出現(xiàn)以及測序成本的降低，通過對全基因組序列信息的分析使微生物進行分類鑒定和抗性潛力變得更加方便快捷。有研究在細菌的基因組中挑選一些在系統(tǒng)進化過程中保守且具有相對較快的變異速率的基因作為補充，如 gyrA［11］、rpoB［12］、gyrB［13］、groEL［14］和 recN［14］等進行聚類分析以提高菌株鑒定的準(zhǔn)確性。

本實驗利用全基因組測序技術(shù)對解淀粉樣芽孢桿菌LM進行全基因組測序，分析其測序數(shù)據(jù)，利用16S rRNA以及gyrA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定菌株，分析次級代謝產(chǎn)物情況等，進行相關(guān)的抑菌試驗，形態(tài)觀察，最后再結(jié)合發(fā)酵液的液質(zhì)分析，了解其中產(chǎn)生的相應(yīng)的物質(zhì)與菌株抗菌活性之間的關(guān)系，闡述其基本的抑菌原理，以便我們發(fā)現(xiàn)其在生物防治和醫(yī)學(xué)中的潛在應(yīng)用價值［15］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens LM），菌株從來自昆明普通的酸菜中利用劃線培養(yǎng)的方法分離得到。供試菌株：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（G-）、白色念珠球菌（Candida albicans）（G+）、黑曲霉（Aspergillus niger）（絲狀真菌）實驗室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株純化、斜面保藏培養(yǎng)基：MRS（DeMan-Rogosa-Sharpe）固體培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏 10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，檸檬酸三銨2 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂20 g。供試培養(yǎng)基：PDA（Potato Dextrose Agar）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，用于供試菌株的培養(yǎng)。

1.1.3 試驗藥品、試劑及儀器 瓊脂糖、Tris、EDTA二鈉，立式滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，PCR 儀：Eppendorf AG 22331 Hamburg，光照培養(yǎng)箱：LRH-250-G 廣東省醫(yī)療器械廠，恒溫?fù)u床：ZHWT-2012 上海智城分析儀器制造有限公司，超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司，臺式高速冷凍離心機：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司，DYOP-31DN型電泳儀、凝膠成像儀：北京市六一儀器廠。

1.1.4 發(fā)酵液液質(zhì)分析的試劑和儀器 儀器：Agilent Technologies 1260 Infinity 11，Agilent Technologies 6420 Triple Quad LC/MS。試劑：甲醇、乙腈均為色譜純、三氟乙酸為分析純：云南新藍景化學(xué)工業(yè)有限公司，娃哈哈純凈水：懷化娃哈哈恒楓飲料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的純化 實驗開始前配置MRS（DeMan-Rogosa-Sharpe）固 體 培 養(yǎng) 基、YPD（yeast extract peptone dextrose）培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基，MRS液體培養(yǎng)基為后面實驗的進行做準(zhǔn)備，將竹簽、培養(yǎng)基提前進行高壓蒸汽滅菌消毒，將培養(yǎng)皿、竹簽等實驗所需器材拿至無菌室超凈工作臺，使用一次性的培養(yǎng)皿倒平板，用YPD培養(yǎng)基制作斜面，待平板冷卻以后，進行接種。用實驗室保存的LM菌株接種到平板上，進行純化。在接種時，要注意通風(fēng)，避免污染。接種完成以后，培養(yǎng)箱32℃培養(yǎng)，觀察菌落的生長狀況。

1.2.2 菌株的形態(tài)觀察 取液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液8 000 r/min離心3-5 min，棄上清，倒入2.5%戊二醛固定液，2.5%戊二醛，2-4 h，磷酸緩沖液清洗3次，乙醇梯度脫水，30%、50%、70%、85%、95%各一次，100%乙醇2次，15-20 min/次接著乙酸異戊酯置換2次，20 min/次。用濾紙吸去多余溶液，充分干燥，可用牙簽充分磨碎樣品，噴金，進行掃描電鏡觀察。

1.2.3 抑菌活性實驗 為了解LM菌株的抑菌特性，選擇3株供試菌株銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）（G-）、白色念珠球菌（C. albicans）（G+）、黑曲霉（A. niger）（絲狀真菌）來進行抑菌實驗（濾紙片法）。把純化保存的菌株LM接種到MRS液體培養(yǎng)基中放入搖床培養(yǎng)（搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，32℃需氧），取第5天的發(fā)酵液取樣10 mL，放入取樣瓶中，8 000 r/min離心3 min取上清樣于離心管中，加入三倍體積的75%的乙醇（殺菌作用），放入冰箱4℃保存。配制含有3種供試菌種的MRS固體培養(yǎng)基，取所需要的濾紙片于裝有發(fā)酵液的離心管中浸泡10 min后取出放于滅菌干凈的玻璃平板上，待濾紙片完全干燥后，貼到含有供試菌種的培養(yǎng)基中，放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，記錄結(jié)果。

1.2.4 培養(yǎng)與DNA提取 從實驗室低溫（4℃）保藏的MRS斜面培養(yǎng)基上刮取適量待測菌株，接種于 100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于28℃下培養(yǎng)48 h后，采用細菌基因組DNA 提取試劑盒（美國BIOMIGA公司）提取基因組 DNA，操作步驟參照試劑盒說明書進行，所得基因組利用 1%的瓊脂糖電泳后在凝膠成像儀上對提取效果進行檢測并用于基因組測序。

1.2.5 全基因組測序數(shù)據(jù)處理及分析 為了研究LM菌株的抑菌的活性，我們進行基因組測序和數(shù)據(jù)分析，通過數(shù)據(jù)分析來探究基因組與菌株抑菌活性之間的關(guān)系，探究基因簇與抑菌活性的關(guān)系。基因組 DNA 提取后經(jīng)過質(zhì)量鑒定，在純度和濃度達到測序要求后，進行基因組全測序。基因組 DNA 提取后采用 Illumina HiSeq 2 000測序平臺完成全基因組雙末端測序，測序深度＞150 x，在進行二代測序之前需要進行文庫的構(gòu)建，還要保證文庫質(zhì)量。將測序得到的原始數(shù)據(jù)進行過濾處理，去除掉低質(zhì)量reads，去除含有堿基N＞3的reads以及adapter 和 duplication 污染后得到有效數(shù)據(jù)［16］。使用unicycler組裝軟件進行拼接組裝，根據(jù)不同的Kmer 值獲得最好的組裝結(jié)果，對結(jié)果進行優(yōu)化，所有的Contig 連接成基因組序列，得到最后的組裝結(jié)果［16］。再將組裝結(jié)果通過antiSMASH對基因組次級代謝基因簇進行預(yù)測，得到相應(yīng)的菌株基因簇預(yù)測信息。

1.2.6 16S rRNA以及gyrA基因分析 從全基因組中找到16S rRNA和gyrA基因序列，通過利用菌株LM 的16S rRNA序列以及gyrA基因序列在NCBI上檢索相應(yīng)序列再利用MEGA7.0構(gòu)建進化樹。

1.2.7 發(fā)酵液液質(zhì)分析及產(chǎn)物預(yù)測 探究了基因組與抑菌活性的關(guān)系后我們還想了解菌株代謝產(chǎn)物中是哪些物質(zhì)在起作用，于是我們進行了發(fā)酵液液質(zhì)分析，想通過液相與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對混合菌樣進行分析得出結(jié)果，再與相關(guān)文獻的比較判斷菌液中起到抑菌抑菌作用成分。樣品制備：取液體培養(yǎng)的菌液20 mL，乙酸乙酯1∶1萃取兩次，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出提取物，最后用色譜甲醇溶解待用。LC/MS質(zhì)譜條件：離子源：ESI；離子模式：正離子Q（+），負(fù)離子Q（-）；掃描模式：全掃描（full scan）；噴霧器（N2）：30 psi；電噴霧電壓：Q（+）5500v，Q（-）5 000V；離子源溫度：350℃；碎片電壓：15V；增益電壓：50V；氣體流速：8 L/min；分子量檢測范圍：200-2 000 amu。樣品LM的LC/MS色譜分析條件：色譜柱Kromasil C8，5u（200×4.6 mm），流動相A：乙腈，流動相B：三氟乙酸水溶液（0.75‰三氟乙酸溶液），進樣量：0.3 μL；流速：0.200 mL/min；梯度洗脫程序：0-20 min（40%-60% A），20-50 min（60%-85% A），50-50.10 min（85%-100% A），分析時間為75 min。

2 結(jié)果

2.1 LM菌株電鏡下形態(tài)觀察

LM菌株電鏡下觀察到的形態(tài)為橢圓形，桿狀，兩端鈍圓（圖1）。與傳統(tǒng)芽孢桿菌及解淀粉樣芽孢桿菌相似，單個大小約為 0.5 μm × 1.7 μm。

圖1 LM菌株電鏡下形態(tài)圖Fig. 1 Morphology of LM strain under electron microscope

2.2 LM菌株的抑菌活性結(jié)果

下圖為LM菌株菌液第7天的抑菌情況（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌液對黑曲霉（Aspergillus niger）有良好的抑菌活性，對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠球菌（Candida albicans）幾乎沒有抑菌作用。

圖2 LM抑菌情況圖Fig. 2 Bacteriostatic picture of LM

2.3 菌株分子鑒定

2.3.1 16S rRNA菌株鑒定 LM菌株的全基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳到NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）登錄號為：JACYOV000000000，我們從全基因組中找到16S rRNA，通過利用菌株LM 的16S rRNA序列在NCBI上檢索序列利用MEGA7.0構(gòu)建進化樹（圖3），所用菌株及GenBank登錄號分別為 Bacillus subtilis subsp. Subtilis 168（NR_102783）、Bacillus amyloliquefaciens DSM7（FN597644）、Bacillus xiamenensis MCCC 1A00008（MG988382）、Bacillus camelliae strain 7578-1（NR_159341）、Lysinibacillus endophyticus C9（NR_146821）發(fā)現(xiàn)LM菌株與解淀粉樣芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）聚在一簇，所以初步鑒定菌株LM為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖3 LM菌株基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of LM strain based on 16S rRNA

2.3.2 gyrA基因序列菌株鑒定 再從全基因組中提取gyrA基因序列，利用gyrA基因到NCBI檢索到菌株名稱及登錄號如下Bacillus amyloliquefaciens DSM7（FN597644），Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-10（CP002905），Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429（CP029465），Bacillus licheniformis ATCC 14580（CP034569），Bacillus licheniformis NCTC10341（LR134392），Bacillus licheniformis ATCC 14580（CP000002），Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580（AE017333），Jeotgalibacillus malaysiensis D5 chromosome（CP009416），構(gòu) 建 系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示發(fā)現(xiàn)LM菌株與Bacillus amyloliquefaciens DSM7菌株聚為一簇，所以初步鑒定其為解淀粉樣芽孢桿菌。

圖4 LM菌株基于gyrA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of LM strain based on gyrA gene

2.4 全基因組測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

通過 Illumina Hiseq2000 平臺測序，因為雜合率較高，所以采用unicycler軟件組裝，進行基因組統(tǒng)計得到基因組大小 4 000 885 bp，GC含量46.24%，共 97個contig，97個scaffold，組 裝 結(jié)果統(tǒng)計信息見表1，表2是LM菌株與NCBI已有B.amyloliquefaciens 菌株的GC含量比較，發(fā)現(xiàn)LM菌株與已有B. amyloliquefaciens菌株基因組大小、GC含量相近。可以進一步確定LM菌株是芽孢桿菌屬下的解淀粉樣芽孢桿菌。

表1 基因組簡單特征統(tǒng)計表Table 1 The table of genome simple feature statistics

表2 LM與已知解淀粉樣芽孢桿菌基因組的比較Table 2 Genome comparison between LM and known B. amyloliquefaciens

2.5 菌株次級代謝基因簇分析

次級代謝產(chǎn)物是微生物在一定的生長時期，以初級代謝產(chǎn)物為前體合成的一系列大分子生長非必需物質(zhì)；通過次級代謝基因蔟分析［17］可以看出（表3），菌株LM具有11個次級代謝產(chǎn)物基因簇，包括芬薺素（Fengycin）、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（Difficidin）、表面活性素（Surfactin）、桿菌素（Bacillibactin）、桿菌烯（Bacillaene）、桿菌霉素D（Bacillomycin D）等生物合成基因簇，相應(yīng)代謝產(chǎn)物有抑菌作用，推測LM菌株抑菌作用與其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物相關(guān)。目前在芽孢桿菌研究中鑒定到的多為Surfactin、Fengycin 和 Bacillomycin D（Iturin類）的3類脂肽抗菌物質(zhì)，我們將編碼這3類物質(zhì)的基因簇與進行功能基因組學(xué)研究的模式菌株Bacillus velezensis FZB42［18］的對應(yīng)基因簇結(jié)構(gòu)進行比較，相似度分別為52%、80%、50%（圖5）。由圖5可觀察到，雖然LM菌株與FZB42菌株的基因簇比對率不高，但其實兩者核心編碼區(qū)（兩豎紅線間的區(qū)域）高度相似，所以兩者產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也應(yīng)該相似。

圖5 三種次級代謝產(chǎn)物基因簇結(jié)構(gòu)比對圖Fig. 5 Comparison of gene cluster structure of three secondary metabolites

表3 菌株次級代謝基因簇分析Table 3 Analysis of secondary metabolism gene cluster of strain

2.6 發(fā)酵液混合體系液質(zhì)分析

通過采用 UPLC-Q-TOF-MS 檢測分析技術(shù)對菌株發(fā)酵提取液進行組分分析，結(jié)合色譜圖各個時間段出現(xiàn)的峰對應(yīng)到質(zhì)譜圖（圖 6-7），根據(jù)相對分子質(zhì)量以及脂肪鏈的“-CH2-”結(jié)構(gòu)特征，對一系列質(zhì)譜圖單一的峰進行解析，質(zhì)譜圖中m/z 1 000-2 000范圍內(nèi)主要有：m/z 1042（A）、m/z 1056（B）、m/z 1070（C）、m/z 1480（D）、m/z 1495（E）、m/z 1509（F）、m/z1524（G）、m/z1007（H）、m/z1022（I）、m/z1036（J）共10個對應(yīng)不同長度的碳鏈脂肪酸［M+H］+峰。根據(jù)相應(yīng)的分子量以及查文獻知，其中質(zhì)譜圖中的對應(yīng)的出峰時間19-25 min的m/z 1042（A）、m/z 1056（B）、m/z 1070（C）［M+H］+峰 是 Iturin類中的bacillomycin D類同系物［6，19］；對應(yīng)的出峰時 間30-35 min的m/z 1480（D）、m/z 1495（E）、m/z 1509（F）、m/z1524（G） 的［M+H］+峰 是Fengycin類同系物［6，20］；而 m/z 1509（F）的峰是C17 Fengycin B，m/z1524（G）的峰是C18 Fengycin B［6，20］；對應(yīng)的出峰時間51-63 min的m/z1007（H）、m/z1022（I）、m/z1036（J），對應(yīng)的是不同長度的碳鏈脂肪酸 Surfactin［M+H］+峰［6，21-23］，表4為發(fā)酵液UPLC - Q - TOF- MS分析結(jié)果統(tǒng)計表。依據(jù)以上結(jié)果推測，該菌株可能產(chǎn)生表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和 芬薺素（fengycin）這 3 類脂肽類抗生素。

圖6 發(fā)酵液UPLC-Q-TOF-MS出峰時間圖Fig. 6 Peak time of fermentation broth UPLC-Q-TOF-MS

圖7 LM發(fā)酵液的UPLC-Q-TOF-MS部分質(zhì)譜圖Fig. 7 UPLC-Q-TOF-MS spectrum of LM fermentation broth

表4 發(fā)酵液的UPLC-Q-TOF-MS分析Table 4 Analysis results of fermentation broth UPLC-Q-TOF-MS

3 討論

本研究提取基因組中的16S rRNA和gyrA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)LM菌株與解淀粉樣芽孢桿菌聚為一簇。將LM菌株的基因組大小、GC含量與NCBI已有菌株比較，最終初步鑒定菌株為解淀粉樣芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens），提高了菌株鑒定的準(zhǔn)確性。

由于芽孢桿菌的活性脂肽類成分較多，且多為同系物，不易分離純化得到純品，鑒定中多采用液質(zhì)聯(lián)用方法，通過保留時間及相對分子量對成分進行定性分析［20-21］，這也是目前鑒定芽孢桿菌脂肽類物質(zhì)最常用的方法。本研究參照夏京津等［6］、張榮勝等［21］、胡陳云等［22-23］對芽孢桿菌抑菌成分鑒定分析方法，UPLC-Q-TOF-MS 檢測結(jié)果表明LM菌株主要產(chǎn)生3類代謝產(chǎn)物，與菌株Bacillus velezensis FZB42［18］合成的surfactin、fengycin 和 bacillomycin D三類脂肽抗菌物質(zhì)分子量相同，初步確定芽孢桿菌LM在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了surfactin、fengycin 和 bacillomycin D三種脂肽類抗菌物質(zhì)。相對于傳統(tǒng)分析方法，通過基因組研究提高了抗菌物質(zhì)分析和預(yù)測的準(zhǔn)確性，基因組與傳統(tǒng)分析方法相互印證。下一步可分離單體化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，確證結(jié)果。

基因組雖然預(yù)測到有多種抑菌物質(zhì)合成的基因簇，但只分析到3類菌脂肽類物質(zhì)，推測部分基因簇未表達或表達量過低，不能檢出，還需要進一步研究。另外在將芽孢桿菌LM主要的3類的基因簇的antiSMASH預(yù)測與已知序列相似度不高，但主要結(jié)構(gòu)基因相似度極高，因此可產(chǎn)生相同的化合物。

4 結(jié)論

結(jié)合形態(tài)特征、16S rRNA序列和gyrA基因聚類分析，初步鑒定菌株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）；UPLC-Q-TOF-MS分析發(fā)現(xiàn)3個化合物的分子量與antiSMASH預(yù)測3種抗菌物質(zhì)基因簇產(chǎn)物的分子量吻合，為表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和 芬薺素（fengycin）等脂肽類抗生素，推測解淀粉芽孢桿菌的抗黑曲霉活性與這3種物質(zhì)有關(guān)。