Paramyrothecium roridum中單端孢霉烯毒素生物合成基因啟動(dòng)子的克隆和功能鑒定

岑由飛 朱牧孜 葉偉 李賽妮 鐘國華 章衛(wèi)民

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物有害生物綜合防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；2. 廣東省微生物研究所 廣東省科學(xué)院 華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070）

單端孢霉烯族毒素主要是由鐮刀菌、單端孢霉、木霉和其他霉菌產(chǎn)生的生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的有毒代謝產(chǎn)物，可污染小麥、大麥、玉米等禾谷類作物，給農(nóng)業(yè)帶來巨大危害［1-2］，同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)單端孢霉烯毒素具有抗腫瘤、抗真菌、抗瘧疾和植物毒活性［3-6］，在藥物開發(fā)方面具有良好的應(yīng)用前景。據(jù)報(bào)道，tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12是單端孢霉烯生物合成的關(guān)鍵基因［7-9］。啟動(dòng)子是能夠準(zhǔn)確與RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，是基因轉(zhuǎn)錄最重要的功能組件。基因表達(dá)水平受多個(gè)因素的影響，其中啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是一個(gè)重要的因素，基因表達(dá)水平高低與啟動(dòng)子啟動(dòng)活性強(qiáng)弱直接相關(guān)［10］。因此，啟動(dòng)子活性的強(qiáng)弱決定了基因的轉(zhuǎn)錄效率，從而決定細(xì)胞中mRNA的總體豐度和目標(biāo)蛋白的含量［11-12］。近年來，人們不斷從絲狀真菌中發(fā)掘出具有很好生物活性的新型次級(jí)代謝產(chǎn)物以及生物酶，但是這些次級(jí)代謝產(chǎn)物以及生物酶的產(chǎn)量在原始菌株中往往很低，為了提高產(chǎn)量，不少絲狀真菌的強(qiáng)啟動(dòng)子相繼被發(fā)掘，如里氏木霉（Trichoderma reesei）的cbh1、pdcl、tef1啟動(dòng)子，橡膠樹白粉菌（Oidium heveae）的WY193啟動(dòng)子，疣孢青霉（Penicillium verruculosum）的xylA啟動(dòng)子，木霉（Trichoderma sp.）的pki1啟動(dòng)子，構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的glaA、trpC啟動(dòng)子等［13-14］。 啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率與啟動(dòng)子中的功能組件密切相關(guān)，常見的啟動(dòng)子功能組件有TATA box，CAAT box和GC box。TATA box能指導(dǎo)起始前復(fù)合物的形成，決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并調(diào)控上游激活蛋白的行為，CAAT box可以提高啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率，GC box是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，有激活轉(zhuǎn)錄的功能［15］。據(jù)報(bào)道，tri5和tri12分別編碼倍半萜環(huán)化酶和MFS協(xié)同超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是單端孢霉烯類化合物生物合成和外排過程中的關(guān)鍵酶［7-8］。

本課題組前期通過熒光定量PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析單端孢霉烯生物合成相關(guān)基因tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12的表達(dá)量，結(jié)果顯示tri5的表達(dá)量最高，tri12的表達(dá)量次之，推測(cè)tri5和tri12的啟動(dòng)子可能具有較強(qiáng)的啟動(dòng)能力［16］。本研究采用染色體步移技術(shù)對(duì)P. roridum A553中單端孢霉烯毒素的生物合成關(guān)鍵基因tri5和tri12啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，采用氨芐青霉素抗性和潮霉素抗性基因表達(dá)載體進(jìn)行功能驗(yàn)證；同時(shí)，為尋找啟動(dòng)子的核心區(qū)域，進(jìn)一步利用熒光素酶載體對(duì)啟動(dòng)子核心區(qū)域進(jìn)行定量分析，并利用軟件對(duì)啟動(dòng)子的功能組件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為后期通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和異源表達(dá)以獲得更多高活性的單端孢霉烯毒素奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑 通用型DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化試劑公司，北京），pEASY-T1 Cloning Kit、DNA Marker 2k（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），Genome walking kit、PrimeSTAR MAX Premix（TaKaRa，大連），2× taq master mix（Microanalysis生物科技公司，北京），ClonExpress II One Step Cloning Kit C112（諾唯贊生物科技有限公司，南京）。

1.1.2 菌株和載體 植物內(nèi)生真菌Paramyrothecium roridum A553分離自藥用植物廣藿香［5］，pET30a載體、YEp352載體、pGL3-basic載體（淼靈生物科技有限公司，武漢），DH5α感受態(tài)細(xì)胞（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），釀酒酵母BJ5464，保藏于廣東省微生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 tri5和tri12啟動(dòng)子的克隆和序列分析 基于前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，根據(jù)Genome walking kit試劑盒說明書，設(shè)計(jì)tri5和tri12啟動(dòng)子序列的特異性反向引物（表1）。以菌株A553基因組DNA為模板，利用通用正向引物和特異性反向引物AP3進(jìn)行3次巢式PCR反應(yīng)，并將巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將最后一步的PCR產(chǎn)物純化回收，回收產(chǎn)物利用pEASY-T1試劑盒進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，利用通用引物T7和T7-ter進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆并提質(zhì)粒測(cè)序加以驗(yàn)證，獲得目的基因tri5和tri12上游相關(guān)啟動(dòng)子片段。將巢式PCR獲得的相關(guān)啟動(dòng)子序列在啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站（https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）進(jìn)行分析獲得啟動(dòng)子序列，并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的核心區(qū)域。

表1 目的基因tri5和tri12特異性反向引物序列Table 1 Specific reverse primer sequences of the target genes tri5 and tri12

1.2.2 啟動(dòng)子-pET30a-Amp、啟動(dòng)子-YEp352-HYRB-CYC1和啟動(dòng)子-pGL3-basic載體構(gòu)建 為了尋找tri5和tri12啟動(dòng)子的核心區(qū)域，以1.2.1克隆得到的啟動(dòng)子片段為模板，設(shè)計(jì)同樣的反向同源臂引物和不同的正向同源臂引物，通過PCR得到tri5和tri12啟動(dòng)子不同長度的片段，分別記為5-f0、5-f1、5-f2和12-f0、12-f1、12-f2。

啟動(dòng)子-pET30a-Amp載體構(gòu)建：設(shè)計(jì)針對(duì)pET30a載體的同源臂引物，利用PrimeSTAR MAX Premix酶，以pEASY-T1載體為模板進(jìn)行PCR得到Amp片段，同時(shí)擴(kuò)增pET30a-ACP載體作為backbone，純化回收PCR產(chǎn)物，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit C112（Vazyme）將Amp片段和pET30a-ACP同源重組連結(jié)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布于卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR和提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，獲得帶有氨芐青霉素抗性的pET30a-Amp空載。設(shè)計(jì)針對(duì)pET30a-Amp空載的同源臂引物，以1.2.1克隆得到的啟動(dòng)子為模板擴(kuò)增得到6個(gè)片段，同時(shí)利用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I對(duì)pET30a-Amp空載進(jìn)行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收并測(cè)定其濃度。利用同源重組試劑盒將6個(gè)啟動(dòng)子片段分別與pET30a-Amp空載體進(jìn)行同源重組連結(jié)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布于卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR和提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。

啟動(dòng)子-YEp352-HYRB-CYC1載體構(gòu)建：設(shè)計(jì)針對(duì)pFC332-HYRB載體的同源臂引物，以pFC332-HYRB載體為模板擴(kuò)增HYRB基因，同時(shí)擴(kuò)增YEp352-TEF1-Amp載體作為backbone，純化回收PCR產(chǎn)物，將其進(jìn)行同源重組連結(jié)，得到Y(jié)Ep352-TEF1-HYRB-CYC1載體。利用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sal I對(duì)YEp352-TEF1-HYRB-CYC1載體進(jìn)行雙酶切除去TEF1啟動(dòng)子，同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)ddYEp352-HYRB-CYC1載體的同源臂引物，以1.2.1克隆得到的啟動(dòng)子為模板擴(kuò)增得到5-f0和12-f1啟動(dòng)子片段，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將這兩個(gè)片段與ddYEp352-HYRB-CYC1載體進(jìn)行切膠回收，利用同源重組試劑盒分別將這兩個(gè)片段與ddYEp352-HYRB-CYC1載體重組連結(jié)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR和提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序結(jié)果正確的重組載體轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞BJ5464，再通過菌落PCR驗(yàn)證。

啟動(dòng)子-pGL3-basic載體構(gòu)建：設(shè)計(jì)針對(duì)pGL3-basic載體的同源臂引物，以1.2.1克隆得到的啟動(dòng)子片段為模板擴(kuò)增得到5-f0和12-f2啟動(dòng)子片段，同時(shí)利用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII對(duì)pgpd-pGL3-basic載體（pgpd是真菌中已鑒定的強(qiáng)啟動(dòng)子［17］）進(jìn)行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，獲得啟動(dòng)子的5-f0、12-f2啟動(dòng)子片段和ddpGL3-basic。利用重組試劑盒將這2個(gè)片段分別與ddpGL3-basic同源重組后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR和提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 氨芐青霉素抗性基因表達(dá)驗(yàn)證 將1.2.2得到的DH5α-pET30a-5-f0/5-f1/5-f2/12-f0/12-f1/12-f2-Amp 轉(zhuǎn)化子以及DH5α-pET30a-ACP空載（陰性對(duì)照）接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，將DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1（陽性對(duì)照）接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)的菌液稀釋至OD600值為 1.0左右，取出10 μL加入到990 μL無菌水中稀釋100倍，記為10-2，然后從10-2取出10 μL加入到90 μL無菌水中稀釋10倍，記為10-3，再從10-3取出10 μL加入到90 μL無菌水中稀釋10倍，記為10-4，從不同濃度菌液中各取5 μL點(diǎn)在氨芐青霉素濃度為0、50、75 μg/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)10-12 h，觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長情況并拍照。根據(jù)點(diǎn)板結(jié)果，將陽性菌株與長出的菌落數(shù)與陽性菌株無差異的菌株分別接種于對(duì)應(yīng)的抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，利用含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基作為稀釋液，按上述方法進(jìn)行稀釋，37℃，180 r/min培養(yǎng)。將不同稀釋濃度的菌液加至96孔板中，每孔200 μL，每個(gè)稀釋菌液設(shè)置五個(gè)重復(fù)，用Thermo多功能酶標(biāo)儀測(cè)定菌株的OD600值。每隔1 h測(cè)定1次，共10次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。利用GraphPad Prism 8.0.1對(duì)相同濃度稀釋菌液的不同菌株的生長OD值進(jìn)行顯著性分析。

由于上述點(diǎn)板結(jié)果不能比較3個(gè)tri5啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性，故重新培養(yǎng)DH5α-pET30a-ACP空載（陰性對(duì)照）、DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1（陽性對(duì)照）和DH5α-pET30a-5-f0/5-f1/5-f2-Amp系列轉(zhuǎn)化子，再按上述方法稀釋，各取5 μL點(diǎn)在氨芐青霉素濃度為0、10、25 μg/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)10-12 h，觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長情況并拍照。

1.2.4 潮霉素抗性基因表達(dá)驗(yàn)證 將1.2.2得到的BJ5464-YEp352-HYRB-CYC1空載（陰性對(duì)照）、BJ5464-YEp352-TEF1-HYRB-CYC1（陽 性 對(duì) 照）、BJ5464-YEp352-5-f0-HYRB-CYC1、BJ5464-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1接種于SD-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，傳代一次再培養(yǎng)24 h。將菌液按1.2.3的方法進(jìn)行稀釋，各取5 μL點(diǎn)在0、75、100 μg/mL潮霉素抗性的YPD平板上，30℃培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長情況并拍照。根據(jù)點(diǎn)板結(jié)果，將陽性菌株與長出的菌落數(shù)與陽性菌株無差異的菌株分別接種于對(duì)應(yīng)的SD-Ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，利用含有潮霉素抗性的SD-Ura培養(yǎng)基作為稀釋液，按1.2.3的方法進(jìn)行稀釋，30℃，180 r/min培養(yǎng)。將不同稀釋濃度的菌液加至96孔板中，每孔200 μL，每個(gè)稀釋菌液設(shè)置5個(gè)重復(fù)，用Thermo多功能酶標(biāo)儀下測(cè)定生長OD600值。每隔6 h測(cè)定1次，共8次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。利用GraphPad Prism 8.0.1對(duì)相同濃度稀釋菌液的不同菌株的生長OD值進(jìn)行顯著性分析。

1.2.5 啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶基因的表達(dá) 將構(gòu)建成功的含有pGL3-5-f0-basic和pGL3-12-f1-basic質(zhì)粒載體和pGL3-pgpd-basic載體的菌株分別接種于含有1.0 mL LB液體培養(yǎng)基的EP管中，37℃，200 r/min培養(yǎng)10-12 h，按1∶100傳代到10 mL LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3-5 h，測(cè)定OD600值。當(dāng)OD600值為0.8-1.0時(shí)，離心收集菌液，并用PBS緩沖液洗滌2-3次，最后用500 μL的PBS重懸，利用手持細(xì)胞超聲儀破碎（振幅 30%，工作3 s/停頓10 s）20 min，12 000 r/min離心2 min，分離上清和沉淀。分別取50 μL上清和50 μL螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑于96孔板中，快速混勻后立即使用Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各反應(yīng)的RU值，反應(yīng)時(shí)間為10 s。

1.2.6 tri5和tri12啟動(dòng)子核心區(qū)域分析 利用在線PlantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)tri5和tri12啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄相關(guān)的功能組件。結(jié)合點(diǎn)板結(jié)果，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的核心 區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 tri5啟動(dòng)子和tri12啟動(dòng)子的克隆分析

通過3次巢式PCR反應(yīng)對(duì)P. roridum A553基因組擴(kuò)增，得到tri5和tri12對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物G1、G2和G3，tri5和tri12最后一次巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物G3的目的條帶大小分別約為2.5 kb（圖1-A）和2.8 kb（圖1-B）。純化回收最后一次巢式PCR產(chǎn)物，利用pEASY-T1試劑盒進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選出陽性克隆，菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆并測(cè)序，獲得tri5和tri12的相關(guān)啟動(dòng)子片段，利用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站（https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測(cè)得到的啟動(dòng)子序列，tri5和tri12啟動(dòng)子大小分別為1 458 bp和1 356 bp。將tri5和tri12啟動(dòng)子序列在網(wǎng)站上進(jìn)行核心區(qū)域分析，分別在網(wǎng)站（https://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）和（https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測(cè)tri5和tri12啟動(dòng)子的核心區(qū)域，分值相對(duì)較高（表2）。

表2 目的基因tri5、tri12啟動(dòng)子核心序列Table 2 Core sequences of tri5 and tri12 promoters

圖1 tri5、tri12染色體步移擴(kuò)增得到的目的片段Fig.1 Target fragments of tri5 and tri12 obtained by chromosome walking

2.2 啟動(dòng)子-pET30a-Amp質(zhì)粒的構(gòu)建及氨芐青霉素抗性的驗(yàn)證

設(shè)計(jì)同源臂引物將tri5和tri12啟動(dòng)子分別分成3個(gè)片段（圖2），與pET30a-ACP空載體同源重組得到重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR驗(yàn)證并測(cè)序成功（圖3-A），得到啟動(dòng)子-pET30a-Amp載體（圖3-B），即得到對(duì)應(yīng)的DH5α-pET30a-5-f0/5-f1/5-f2/12-f0/12-f1/12-f2-Amp菌株。將這6個(gè)菌株及DH5α-pET30a-ACP空載（陰性對(duì)照）與DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1（陽性對(duì)照）接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，將菌液稀釋后分別點(diǎn)在氨芐青霉素抗性濃度為0、50、100 μg/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h。發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL氨芐青霉素抗性板上只有DH5α-pET30a-12-f1-Amp和DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1長出菌落（圖4-A），通過測(cè)定生長曲線和顯著性分析發(fā)現(xiàn)，相同稀釋濃度的DH5α-pET30a-12-f1-Amp和DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1的生長OD值沒有顯著性差異（P＞0.05，圖4-C），說明tri12啟動(dòng)子片段12-f1和陽性對(duì)照啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率均比tri5啟動(dòng)子片段5-f0強(qiáng)，而tri12啟動(dòng)子片段12-f1的啟動(dòng)效率與陽性對(duì)照啟動(dòng)子相當(dāng)。

圖2 構(gòu)建具有不同長度片段的tri5和tri12基因啟動(dòng)子Fig.2 tri5 and tri12 promoters with different lengths of fragments

為了確定3個(gè)tri5啟動(dòng)子片段的啟動(dòng)效率，重新培養(yǎng)含tri5啟動(dòng)子片段的菌株以及DH5α-pET30a-ACP空載（陰性對(duì)照）和DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1（陽性），將菌液稀釋后分別點(diǎn)在氨芐青霉素抗性濃度為0、10、25 μg/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h。發(fā)現(xiàn)在25 μg/mL的平板上只有DH5α-pET30a-ACP空載（陽性對(duì)照）和DH5αpET30a-5-f0-Amp長出菌落（圖4-B），且菌落數(shù)較多，說明tri5的啟動(dòng)子片段中，5-f0的啟動(dòng)效率最強(qiáng)。

圖4 不同濃度的氨芐青霉素抗性平板篩選含不同啟動(dòng)子片段的大腸桿菌Fig.4 Screening of E. coli containing different promoter fragments on resistance plates with different concentrations of ampicillin

2.3 啟動(dòng)子-YEp352-HYRB-CYC1質(zhì)粒的構(gòu)建及潮霉素抗性的驗(yàn)證

設(shè)計(jì)針對(duì)YEp352載體的同源臂引物，將tri5和tri12啟動(dòng)子分別分成3個(gè)片段，與雙酶切的YEp352-HYRB-CYC1載體進(jìn)行同源重組連結(jié)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR驗(yàn)證并測(cè)序成功（圖3-C），得 到Y(jié)Ep352-5-f0/5-f1/5-f2/12-f0/12-f1/12-f2-HYRB-CYC1載 體（圖3-D）。將YEp352-TEF1-HYRB-CYC1（陽 性 對(duì) 照）、YEp352-No pro-HYRB-CYC1（陰 性 對(duì) 照）、YEp352-12-f1-HYRBCYC1和YEp352-5-f0-HYRB-CYC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞BJ5464。通過菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明這4個(gè)載體都成功轉(zhuǎn)入酵因細(xì)胞中。將成功轉(zhuǎn)入YEp352系列載體的酵母菌株分別接種至SDUra液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2 d，將菌液稀釋后分別點(diǎn)在潮霉素濃度為0、25、50、75 μg/mL的YPD平板上，37℃培養(yǎng)2 d，發(fā)現(xiàn)在75 μg/mL的YPD上BJ5464-YEp352-5-f0-HYRB-CYC1的菌落數(shù)極少，而BJ5464-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1和BJ5464-YEp352-TEF1-HYRB-CYC1的菌落數(shù)較多（圖5-A），通過測(cè)定生長曲線和顯著性分析發(fā)現(xiàn)，相同稀釋濃度的BJ5464-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1和BJ5464-YEp352-TEF1-HYRB-CYC1的生長OD值均沒有顯著性差異（P＞0.05，圖5-B），說明tri12啟動(dòng)子片段12-f1和陽性對(duì)照啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率均比tri5啟動(dòng)子片段5-f0強(qiáng)，而tri12啟動(dòng)子片段12-f1的啟動(dòng)效率與陽性對(duì)照啟動(dòng)子相當(dāng)。

圖3 DH5α菌落PCR驗(yàn)證及啟動(dòng)子載體Fig.3 Colony PCR verification of DH5α and promoter vector maps

圖5 不同濃度的潮霉素抗性平板篩選含不同啟動(dòng)子片段的釀酒酵母Fig.5 Screening of S. cerevisiae containing different promoter fragments on resistant plates with different concentrations of hygromycin

2.4 熒光素酶活性檢測(cè)

利用同源重組的方法成功構(gòu)建了分別含有5-f0、12-f0啟動(dòng)子片段的pGL3-basic重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并通過菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證。利用熒光素酶檢測(cè)試劑對(duì)成功導(dǎo)入pGL3-basic重組載體的重組菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖6）顯示含有pgpd啟動(dòng)子的菌株其熒光素酶活性均高于含有5-f0和12-f0啟動(dòng)子片段的重組菌，含有5-f0啟動(dòng)子片段的重組菌的熒光素酶活性高于含有12-f1啟動(dòng)子片段的重組菌，說明5-f0啟動(dòng)子片段對(duì)熒光素酶基因的啟動(dòng)效率高于12-f1啟動(dòng)子片段。這與點(diǎn)板的結(jié)果相反，說明同一個(gè)啟動(dòng)子在啟動(dòng)不同基因時(shí)的啟動(dòng)效率不同。

圖6 pGL3-5-f0-basic、pGL3-12-f1-basic和pGL3-pgpdbasic載體在DH5α中的熒光素酶活性檢測(cè)Fig.6 Luciferase activity detection of pGL3-5-f0-basic，pGL3-12-f1-basic and pGL3-pgpd-basic vectors in DH5α

2.5 tri5和tri12啟動(dòng)子活性區(qū)域分析

利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的功能組件，結(jié)合啟動(dòng)子序列特點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在tri5啟動(dòng)子的-43處有一個(gè)TATA box，使轉(zhuǎn)錄精確起始；在啟動(dòng)子的-66處有一個(gè)CAAT box，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。在tri12啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游30-50 bp處并沒有TATA box，因此認(rèn)為該啟動(dòng)子是一個(gè)TATAless啟動(dòng)子；但在啟動(dòng)子的-54處有一個(gè)CAAT box，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率；在CAAT-box前面與其相連有一個(gè)GC box，起到激活轉(zhuǎn)錄的作用（圖7）。結(jié)合點(diǎn)板的結(jié)果分析，片段5-f0啟動(dòng)活性強(qiáng)于5-f1，5-f2，說明tri5啟動(dòng)子的ATG上游941-1 458 bp之間存在正向調(diào)控的功能組件，可增強(qiáng)啟動(dòng)活性。片段12-f1的啟動(dòng)活性顯著高于12-f0和12-f2，表明在tri12啟動(dòng)子的ATG上游999-1 356 bp之間和1-516 bp之間存在轉(zhuǎn)錄抑制因子，影響啟動(dòng)活性；而ATG上游516-999 bp之間存在正向調(diào)控的功能組件，可增強(qiáng)啟動(dòng)活性，即說明片段12-f1就是tri12啟動(dòng)子的核心區(qū)域。

圖7 tri5和tri12功能組件預(yù)測(cè)Fig.7 Functional component prediction of gene tri5 and tri12

3 討論

絲狀真菌中次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成需要一些關(guān)鍵酶的調(diào)控，而轉(zhuǎn)錄效率高的啟動(dòng)子可以啟動(dòng)關(guān)鍵酶的高效表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的高效生物合成［17］。絲狀真菌中的許多強(qiáng)啟動(dòng)子已經(jīng)用于內(nèi)源或外源蛋白的表達(dá)，例如構(gòu)巢曲霉甘油醛3磷酸脫氫酶啟動(dòng)子（PgpdA）用于異源表達(dá)治療性蛋白質(zhì)-人干擾素β（HuIFNβ）［18］，里氏木霉CBH1啟動(dòng)子用于異源表達(dá)纖維二糖水解酶Cel7A［19］。單端孢霉烯毒素是一類抗腫瘤活性顯著的倍半萜類化合物，其生物合成基因簇已被許多文獻(xiàn)報(bào)道，其中tri5、tri12是單端孢霉烯合成家族tri簇中不可或缺的關(guān)鍵基因。tri5編碼的倍半萜環(huán)化酶是單端孢霉烯生物合成中的關(guān)鍵酶，可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高單端孢霉烯類化合物的產(chǎn)量。tri12不直接參與單端孢霉烯的生物合成，但其編碼的MFS協(xié)同超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在毒素外排的過程中起著關(guān)鍵性作用，防止毒素在細(xì)胞內(nèi)過量積累而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，毒素只有源源不斷地外排，才能源源不斷地在細(xì)胞內(nèi)合成。盡管已報(bào)道了不少單端孢霉烯生物合成基因，但這些基因的啟動(dòng)子卻很少被研究。

本研究對(duì)露濕漆斑菌中tri簇關(guān)鍵基因tri5和tri12啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆和功能鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者都具有良好的轉(zhuǎn)錄活性，提示其啟動(dòng)子在單端孢霉烯生物合成中發(fā)揮著重要作用。氨芐青霉素抗性基因和潮霉素抗性基因分別是原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中最常見的抗性篩選基因，因此，本課題組利用這兩種抗性基因?qū)ri5和tri12啟動(dòng)子的核心區(qū)域進(jìn)行鑒定［20］，在后續(xù)的研究中還可將啟動(dòng)子整合至釀酒酵母染色體上進(jìn)一步驗(yàn)證其活性。為了尋找啟動(dòng)子核心區(qū)，本研究將tri5和tri2啟動(dòng)子進(jìn)行分段克隆，發(fā)現(xiàn)片段12-f1的轉(zhuǎn)錄活性比其他片段的轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)，因此可通過改造啟動(dòng)子而增強(qiáng)其活性。同時(shí)，通過對(duì)tri5和tri2啟動(dòng)子的克隆以及在酵母細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩種啟動(dòng)子也能在酵母細(xì)胞中調(diào)控潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，說明它們?cè)谠松锖驼婧松镏芯哂袉?dòng)活性，提示這兩種啟動(dòng)子可用于不同宿主異源表達(dá)單端孢霉烯的高效生物合成。本研究為后期通過對(duì)P. roridum A553中單端孢霉烯毒素生物合成基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控和異源表達(dá)奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)植物內(nèi)生真菌Paramrothecium roridum A553中tri5和tri2兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆，采用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)以及熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)對(duì)tri5和tri2啟動(dòng)子的核心區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)tri5和tri2啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的啟動(dòng)基因表達(dá)的能力且能夠在酵母細(xì)胞中調(diào)控潮霉素基因的異源表達(dá)。最后利用軟件分析預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子中的關(guān)鍵功能組件。