靈芝酸生物合成及代謝調控研究進展

袁愷 何偉 楊云麗 朱威宇 彭超 安泰 李麗 周衛強

（1. 中糧營養健康研究院有限公司，北京102209；2. 營養健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；3. 北京工商大學化學與材料 工程學院，北京 100048）

靈芝酸（ganoderic acids，GAs）是靈芝三萜酸的簡稱，約占靈芝三萜類物質的三分之一［1］。盡管已經被證明其具有出色的藥用價值，但是從天然靈芝的子實體和孢子中提取GAs，存在靈芝栽培工作量大、時間長、生長環境要求高、GAs含量低等問題，極大地限制了其商業應用和開發。近年來，靈芝菌深層液體發酵技術逐漸成為獲取GAs的重要方法，而靈芝酸生物合成途徑的解析和調控對于解決發酵生產靈芝酸低產量問題又意義重大。本文從GAs的合成代謝途徑出發，首先介紹了利用基因工程手段對GAs合成代謝途徑進行調控的實施案例，隨后系統梳理了信號傳導途徑以及生物表觀遺傳在提高GAs積累量方面的作用原理，并繪制出示意圖，希望為今后進一步提高深層液體發酵產GAs產量提供研究思路。

1 靈芝酸

1.1 靈芝酸簡介

靈芝酸是靈芝菌的主要活性成分之一［2］。自1982年Kubota［3］首次分離得到靈芝酸A、靈芝酸B以來，已經超過100多種GAs被分離出來，其主要結構見圖1。GAs已經被證明具有抗腫瘤［4-6］、抗炎［7］、抑菌［4］、抗衰老［8］、助睡眠［9］等作用。例如，靈芝酸A具有抑制炎癥、治療人膠質瘤、保肝、抑菌等作用［4，7］，靈芝酸DM可以抑制黑色素瘤［10］，靈芝酸D可以抑制結腸癌［5］等。在靈芝菌深層液體發酵生產GAs的過程中，發酵參數，如溫度、pH、溶氧等，外源物質，如植物激素、油脂、苯巴比妥等都對GAs的生物合成代謝有直接影響作用［11-12］。

1.2 靈芝酸的合成代謝途徑

Shiao通過13C同位素標記證明GAs的生物合成是由甲羥戊酸（MVA）合成代謝途徑起始［13］，并通過3個階段合成（圖1）。第一階段：前體物質生成。首先3分子的乙酰輔酶A經過2次縮合形成3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA），隨后在3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）的作用下生成MVA。再經過甲基戊酸激酶（MK）和甲羥戊酸激酶（MPK）焦磷酸化、甲羥戊酸脫羧酶（MVD）脫羧化作用下生成異戊烯焦磷酸（IPP）。IPP在異戊二烯焦磷酸異構酶（IDI）激活下可異構化生成二甲丙烯焦磷酸（DMAPP）。2分子IPP和1分子DMAPP在法尼基磷酸合酶（FPS）催化下頭尾縮合成法尼基焦磷酸（FPP）。第二階段：羊毛甾醇骨架生成。首先FPP在鯊烯合成酶（SQS）催化下轉化為鯊烯，隨后在羊毛甾醇合成酶（LSS）催化下生成羊毛甾醇。第三階段：GAs的合成。羊毛甾醇經過氧化、羥基化和糖基化生成不同結構的GAs。

圖1 靈芝酸生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathways of GAs

在GAs的合成途徑中，第一、二階段已經得到了系統性的研究，涉及的重要酶也被鑒定和表征。但是第三階段的生物轉化過程還未完全闡明。Chen等［14］發現細胞色素P450單加氧酶（CYP450）催化羊毛甾醇成為不同的GAs。同時基因測序發現有214個CYPs與靈芝酸下游合成途徑相關，其中有78個CYPs與LSS共表達，猜測這78個CYPs可能參與到靈芝酸骨架結構修飾中。另外有198個CYPs分屬于24個基因簇，其中有5個基因簇與LSS共表達，說明它們在GAs生物合成中發揮作用［15］。例 如CYP512U6負 責 催 化 合 成 靈 芝 酸ZXYL［16］，CYP505D13則配合生成環狀靈芝三萜［17］等。

2 靈芝酸合成代謝途徑的基因調控

作為次級代謝產物，尤其是存在多種支路的情況下，GAs的合成和積累嚴格受限于合成代謝途徑中關鍵基因的轉錄水平。因此，代謝通路中關鍵酶的過表達和異源表達成為獲得GAs高積累量的最直接最有效手段。

2.1 關鍵酶基因的過表達

在GAs合成代謝途徑的上游有HMGR、FPS、SQS、LSS［18］這4個關鍵酶，其基因表達量與GAs的積累量密切相關。鐘建江課題組［19］使用同源標記基因Cbxr，利用農桿菌介導轉化法將N端截斷的hmgr（t-HMGR）基因片段導入靈芝細胞中，對HMGR催化域進行過表達。在發酵的第8天，fps、sqs、ls的基因轉錄水平出現上調，GAs水平急劇升高，發酵結束后t-HMGR基因過表達菌株中角鯊烯、羊毛甾醇和GAs含量比出發菌株分別高6.7、3.8、2倍。

作為MVA生物合成途徑的第一個多分支點，FPS活性直接影響異戊烯焦磷酸（IPP）的催化路徑［20］。Fei等［21］通過過表達fps發現，基因sqs和ls轉錄水平分別上調2.8倍和1.73倍，GAs、靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸Me的含量分別為2.76、41、21、28 μg/100 mg菌絲體，比空白組分別高出2.28、2.27、2.62、2.80倍。與Ding等［22］上調fps轉錄水平的結果相同。類似于FPS，SQS通過控制法尼基焦磷酸將代謝流引向靈芝酸合成代謝途徑，從而避免形成半倍萜。Zhou等［23］通過過表達sqs，轉錄水平提高15.6倍，鯊烯和羊毛甾醇含量分別增加1.55倍和1.68倍，靈芝酸Mk、T、Me、S的含量分別是16、40、43、53 μg/100 mg，比出發菌株高2.86、2.67、1.95、1.25倍。

LSS催化2，3-氧化鯊烯形成羊毛甾醇，過表達lss可以為GAs的生物合成提供足夠的前體物質。研究結果顯示原基時期的lss表達量顯著高于菌絲體中的lss表達量，GAs含量呈現相同趨勢［24］。Zhang等［25］過表達lss后羊毛甾醇積累量提高了2.3倍，靈芝酸O、Mk、T、S、MI、Me的含量分別達到4.66、24.30、69.80、28.90、15.4、26.70 μg/100 mg，相 比出發菌株提高6.1、2.2、3.2、4.8、2.0、1.9倍。

2.2 關鍵基因的異源表達

發酵周期長是制約GAs商業應用的另一個主要因素。根據其他次級代謝產物的生產經驗，在合適的底盤微生物中實現異源表達將有效縮短發酵周期，同時也利于進一步提升GAs積累量。青蒿酸［26］、彌羅松酚［27］、人參皂苷［28-29］等植物來源的天然產物已經實現了異源表達，但是目前GAs的異源表達報道十分少。Wang等［30］通過體外酶促實驗證明羊毛甾醇氧化酶CYP510L8通過3步催化羊毛甾醇的第二十六位碳轉化成為靈芝酸Z，經異源表達cyp150l8，又成功實現靈芝酸Z在釀酒酵母中的合成，發酵120 h后產量約為14.5 mg/L。為了進一步提高CPY510L8活力，研究人員構建了新的異源表達體系CYP510L8-iGLCPR融合蛋白（一種細胞色素P450還原酶），實現胞內H+的快速轉移，從而靈芝酸Z產量提升至154.45 mg/L，相比出發菌株提高了10倍［31］。毫無疑問，基因工程手段可以實現GAs的異源表達，而且更方便進行代謝調控、過程調控等方面的優化。其次，選擇合適的宿主也十分重要。比如上述研究中選擇釀酒酵母，一方面是因為它可以自行合成羊毛甾醇，為GAs合成提供前提物質。另一方面是利用其內質網和翻譯修飾系統可以表達CYP510L8和iGLCPR的優勢。

由此可見，通過基因工程手段對重要節點的酶的基因進行過表達或抑制，可以將胞內代謝流導向GAs的合成代謝分支，直接有效達到目標產物產量積累的目的。此外，盡管還存在關鍵酶功能解析不完全、合適宿主的選擇困難等諸多障礙，但是通過構建異源表達系統提高GAs的生產效價這一路徑極有發展前景。

3 靈芝酸合成代謝途徑的信號轉導調控

信號轉導途徑即細胞對某些特定刺激做出反應的分子途徑。通過信號轉導實現對微生物代謝途徑的調控已經發展成為一種強有力的策略。在GAs代謝途徑中，目前已經發現的轉導信號包括鈣調磷脂酶信號、活性氧信號、細胞壁完整性信號、茉莉酮酸（JA）及其衍生物信號、NO信號、cAMP信號等 （表1）［32-34］。

表1 靈芝酸生物合成途徑的信號轉導調控Table 1 Signal transduction regulation of ganoderma acid biosynthesis pathway

3.1 鈣調磷脂酶信號

鈣調磷脂酶信號的作用途徑是，細胞內Ca2+濃度升高并與鈣調蛋白（基因cam）形成Ca2+/鈣調蛋白復合物，隨后與鈣調磷脂酶的催化亞基（基因cna）相互作用并激活轉錄因子鋅指蛋白（基因crz1）［32］。在GAs合成代謝途徑中，基因sqs和lss的啟動子區域有一個CDRE序列，受CRZ1的正向調節。Xu等［35］發現當在培養基中加入Ca2+后，參與鈣調磷脂酶信號的cam、cna、crz1和GAs合成代謝途徑的關鍵酶基因hmgr、sqs、lss的表達量均出現明顯上調，GAs含量增加了3.7倍，靈芝酸MK、靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸Me分別增加了2.6倍、4.5倍、3.2倍和3.8倍。Na+和Mn2+具有相同作用機制，通過胞內Ca2+濃度增加并激活鈣調磷脂酶信號從而實現GAs合成代謝途徑的正向調節，分別將GAs含量提高了2.8倍和2.7倍［36-37］。

3.2 活性氧信號

活性氧（reactive oxygen species，ROS）平衡調節系統是一種廣泛存在于細胞內的復雜調節機制，涉及多種氧化應激相關基因，對微生物合成代謝途徑影響較大［43-44］。Glswi6是G. lucidum ACCC53264的APSES轉錄因子，其轉錄表達與靈芝菌的發育以及生物合成代謝途徑密切相關。相比于野生型菌株，Zhang等［38］發現Glswi6沉默菌株的NAHD氧化酶活性下降48%，H2O2含量下降50%。同時，GAs合成代謝途徑的關鍵基因hmgr、sqs、lss轉錄水平均下調，GAs產量降低25%。通過回補1 mmol/L H2O2，關鍵基因的轉錄水平和GAs的產量恢復至野生型菌株水平。轉錄因子GlSkn7參與細胞壁的合成、孢子形成及胞內氧化應激反應，是ROS系統不可或缺的一部分，維持ROS的穩態。以靈芝菌G. lucidum ACCC53264為原始菌株，通過敲除Glskn7獲得的Skn7i-5和Skn7i-7菌株，H2O2含量上升73.7%和76.4%，ROS水平是原始菌株的1.78和1.82倍，GAs分別提高了52.1%和55.9%。轉錄組數據顯示hmgr轉錄水平上升56%、52%，sqs上調49%、53%，lss上調95%、93%。在突變菌株中加入5 mmol/L活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC），GAs濃度降低至與野生型菌株相同水平［39］。同樣地，當轉錄因子PacC沉默時，胞內SOD、CAT、Gpx、Apx等抗氧化酶活性下降幅度超過40%，ROS水平上升幅度超過2倍，GAs積累量明顯提升［40］，而回補1 mmol/L NAC 和 2 mmol/L維生素C時，突變菌株的GAs水平下降并與出發菌株持平［41］。這些研究結果表明胞內ROS水平與GAs合成代謝水平存在相關性，隨著胞內ROS水平的變化，轉錄因子隨之變化并對GAs合成代謝途徑產生調控作用［45］。

3.3 細胞壁完整性信號

當植物生存環境受到外界脅迫時，會產生對植物具有保護作用的次級代謝物質，提高生存競爭力［46］，而細胞壁是植物應答外界脅迫的第一環節。細胞壁完整性（cell wall intesrity，CWI）信號由絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）模塊組成，主要參與細胞壁完整性調控。經數據庫對比、功能域和進化樹分析，在G. lucidum HG菌株發現了編碼MAPK模塊的基因mapk4。與野生型菌株相比，多株mapk4沉默菌株都表現出生長速率減慢、菌絲分叉增多、細胞壁厚度減小。關鍵基因hmgr、sqs、lss轉錄水平下調明顯，鯊烯、羊毛甾醇含量分別下降55%和50%，GAs含量最大降低40%。同時，研究人員還發現部分mapk4沉默菌株中H2O2含量約減少70%，NADPH氧化酶家族（noxA、noxB、noxR）基因表達量降低［42］，這與Glswi6的調控路徑高度一致。

由此看來，Ca2+、ROS、CWI、NO、cAMP、JA以及其衍生物的信號轉導途徑并不是單獨作用，而是相互影響的，并且主要以鈣調磷脂酶信號和ROS信號為主（圖2）。其次，與以單個基因為靶點的關鍵酶過表達方法不同，信號轉導途徑通過影響涉及多個代謝途徑的大量基因，從而實現對這些途徑的整體上調或下調。

圖2 靈芝菌胞內信號轉導示意圖Fig. 2 Schematic diagram of intracellular signal transduction in G. lucidum

4 全局性調控因子與生物表觀遺傳的調控

不同于調控單一基因的特異性調控因子，全局性調控因子能夠同時調控多個基因簇內的基因表達，實現對多種次級代謝產物的生物合成干預。生物表觀遺傳是微生物調控自身次級代謝產物合成的一種方式，其分子機制有DNA甲基化、羥甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、核小體定位以及非編碼RNA調控等。

4.1 全局性調控因子LaeA

靈芝菌中全局性調控因子LaeA可以通過激活沉默基因表達實現增加GAs積累量的目的。賀望興等［47］發現振蕩培養和液體靜置培養兩種方式下LaeA表達出現差異，靜置培養下LaeA表達量和GAs含量均高于振蕩培養，倍數分別為3.3和9.4倍，因此研究人員猜測蛋白LaeA通過轉錄調控影響GAs的次級代謝途徑。有人推測類似于構巢曲霉，LaeA是與Velvet蛋白家族的2個成員形成LaeAVeA-VelB三聚體復合物從而調控著靈芝的次級代 謝［48-49］，但是真正的機制有待探索。

4.2 DNA甲基化

DNA甲基化是維持植物正常發育必須的，具有不可替代的作用。藍麗雯等［50］利用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-AC）對GAs的代謝進行誘導。研究發現，在靈芝的液體靜置培養基中添加1 mmol/L 5-AC時，靈芝孢子中靈芝酸Mk、T、S、Me含量達到最高，是對照組的3-4倍。靈芝酸Mk和靈芝酸S的含量分別達到13.10和12.33 mg/g。hmgr、sqs、se和lss的表達量分別是對照組的6.26、3.10、3.42和4.32倍。同時，研究人員還發現全局性調控因子LaeA的表達量是對照組的2.83倍，間接證明激活LaeA的表達有利于提高GAs積累量。

4.3 組蛋白乙酰化

組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferases，HATs）可以通過開啟沉默基因實現對次級合成代謝途徑的調控。辛二酰苯胺異羥肟酸（vorinostat，SAHA）能有效抑制組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的活性，從而促進組蛋白的乙酰化。通過向培養基中加入180 μmol/L的SAHA，靈芝培養第9天時組蛋白去乙酰化酶RPD3水平上調，其轉錄水平是對照組的6倍，組蛋白H3乙酰化的水平無差異，組蛋白H4乙酰化的水平是對照組的1.6倍。在靈芝培養第6、12天時檢測GAs的含量比對照組降低36%、45%。向培養基中加入60 μmol/L和180 μmol/L的SAHA，在第6天檢測hmgr、sqs、se和lss基因表達量均高于空白組，而在第12天時這4個基因表達量均低于空白組。對全局性調控因子LaeA和Velvet檢測發現，不同SAHA濃度、不同天數下靈芝菌的LaeA和Velvet表達均受到抑制［51］。因此猜測靈芝中的組蛋白乙酰化水平的上升抑制了全局調控因子LaeA和蛋白Velvet的表達，從而導致GAs的積累量降低。

綜上發現，全局調控因子與表觀遺傳存在緊密的聯系。通過抑制DNA甲基化，全局性調控因子LaeA的表達量增加，GAs合成代謝途徑正向激活。組蛋白乙酰化會抑制全局調控因子LaeA和Velvet的表達，導致GAs的積累量降低。

5 總結與展望

在GAs合成代謝途徑方面，前兩個階段的多個關鍵酶已經被克隆表征，并得到研究。第3個階段中，目前發現78個CYP450可能參與到GAs骨架結構修飾中，但是僅僅闡明cyp5150l8、cyp512U6、cyp505D13這3種基因參與下游途徑，其余CYP450s的作用機制仍不清晰，這將是未來研究的重點方向之一。在信號轉導途徑方面，目前已經發現了多種信號轉導途徑以及之間存在的相互作用，未來將會聚焦到轉錄因子對GAs合成基因的影響機理上，例如利用染色質免疫沉淀-測序等技術揭示調控元件的高維相互關系水平，并從頭注釋新的功能基因組區域。在全局性調控因子與生物表觀遺傳方面，構建靈芝工程菌時可以通過減少DNA甲基化水平和組蛋白乙酰化水平以促進GAs的合成代謝。

完全解析GAs的合成代謝途徑、共表達多個關鍵酶以增強代謝流、挖掘信號轉導途徑的深層作用機制、尋找合適的底盤生物實現其異源表達，整合轉錄、RNA加工和翻譯，以及翻譯后的修飾等多水平調控，將在靈芝深層液體發酵工藝中實現周期短、效價高的最終目的，并為GAs商業應用的進一步擴大打下基礎。