涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法檢測在疑似肺結核患者臨床診斷中的應用

蘭劍鋒 劉淑燕

1.深圳市第三人民醫院 南方科技大學附屬第二醫院感染病國家臨床重點專科，廣東深圳 518112；2.深圳市第三人民醫院 南方科技大學附屬第二醫院肝病研究所，廣東深圳 518112

據世界衛生組織報道，全球2018年有1000萬左右結核病人群，其中90%左右為成年人[1]。結核病屬于傳染病，其主要由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起，以肺結核最為常見[2]。當前國內診斷肺結核以患者臨床表現、X線檢查結合實驗室檢查[痰涂片抗酸染色法（涂片法）、羅氏培養法（L-J法）]為主[3-4]。但涂片法敏感度較低，MTB培養法耗時長。因此，十分有必要采取更高效的肺結核病原學檢查方法。近些年多種分子生物學技術在臨床疾病診斷中的應用范圍較廣[5-6]。目前國內雖然將分子生物學技術應用于肺結核診斷的研究報道較多，但其尚無統一定論。為此，本研究探究涂片法、L-J法、結核分枝桿菌MGIT 960液體培養（MGIT 960法）及GeneXpert MTB/RIF檢測（GeneXpert法）在疑似肺結核臨床診斷中的應用價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月至2020年12月深圳市第三人民醫院收治的80例疑似肺結核患者，其中男58例，女22例；年齡18～76歲，平均（41.52±9.37）歲。納入標準：①存在低熱、咳嗽、盜汗、咯血等癥狀，或影像學胸部檢測結果類似于活動性肺結核表現；②均為首次來院就診；③入組前2年內無抗結核藥物使用史；④患者知情同意。排除標準：①存在心、肝等嚴重疾病者；②有明確精神疾病者；③正參與其他相關研究者。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

所有患者均采集痰標本，進行涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法檢測。

1.2.1 涂片法 將每份痰標本進行涂片，待涂片自然干燥后采取萋-尼抗酸染色，并在顯微鏡下進行抗酸桿菌檢查，其檢查方法及結果判斷以《結核病實驗室檢驗規程》[7]為依據。本研究所用染色液為山東拓普生物工程有限公司生產，產品編號S0021；儀器為麥克奧迪實業集團有限公司生產的BA210-T生物顯微鏡，產品編號V506499。

1.2.2 L-J法 抗污染液化處理痰標本后，采集0.1 ml標本并將其在羅氏培養基中接種，仔細觀察培養基狀況，如果有菌落生長則進行涂片鏡檢，陽性者即為L-J法檢測陽性。本研究所用改良羅氏培養基為海博生物技術有限公司生產，產品貨號HB6250-1。

1.2.3 MGIT 960法 以BACTEC MGIT 960系 統操作說明書為依據進行MGIT 960法檢測，采集痰標本0.5 ml于50 ml離心管中，再向其中加入NALC-NaOH 1～2 ml，待震蕩處理后加入磷酸鹽緩沖液40 ml進行離心，待離心后棄上清液，再加入磷酸鹽緩沖液1 ml進行重懸沉淀，最后采集0.1 ml標本并將其在備好的培養管中接種。并將儀器顯示陽性的標本進行涂片鏡檢以明確結核桿菌生長。本研究所用儀器及配套試劑為美國BD公司生產。

1.2.4 GeneXpert法 以GeneXpert MTB/RIF操作說明書為依據進行GeneXpert法檢測，采集痰標本1 ml，再向其中加入標本處理液2 ml，待震蕩處理15 min后采集2 ml液化標本置于反應盒中，再將反應盒置于檢測儀中進行自動檢測，檢測結果可在檢測系統窗口下直接觀察。本研究所用儀器及配套試劑為美國Cepheid公司提供。

1.3 觀察指標

以《WS 288-2017肺結核診斷》[8]標準為依據，比較涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法單獨檢測及聯合檢測在疑似肺結核患者臨床診斷中的敏感度、特異度、陽性預測值及陰性預測值。其中敏感度=真陽性數/（真陽性數+假陰性數）×100%；特異度=真陰性數/（真陰性數+假陽性數）×100%；陽性預測值=真陽性數/（真陽性數+假陽性數）×100%；陰性預測值=真陰性數/（真陰性數+假陰性數）×100%。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床診斷結果

在80例疑似肺結核患者中，有41例肺結核患者，39例非肺結核患者。

2.2 四種方法單獨檢測結果

以臨床診斷結果為金標準，涂片法檢測出19例陽性，61例陰性，其診斷的敏感度為36.59%（15/41）、特異度為89.74%（35/39）、陽性預測值為78.95%（15/19）、陰性預測值為57.38%（35/61）；L-J法檢測出15例陽性，65例陰性，其診斷的敏感度為31.71%（13/41）、特異度為94.87%（37/39）、陽性預測值為86.67%（13/15）、陰性預測值為56.92%（37/65）；MGIT 960法檢測出21例陽性，59例陰性，其診斷的敏感度為43.90%（18/41）、特異度為92.31%（36/39）、陽性預測值為85.71%（18/21）、陰性預測值為61.02%（36/59）；GeneXpert法檢測出16例陽性，64例陰性，其診斷的敏感度為39.02%（16/41）、特異度為100.00%（39/39）、陽性預測值為100.00%（16/16）、陰性預測值為60.94%（39/64）。四種檢測方法檢測敏感度比較，差異無統計學意義（χ2=1.349，P=0.718＞0.05）；GeneXpert法檢測特異度比涂片法、L-J法、MGIT 960法高（χ2=9.662，P=0.022＜0.05）。見表1～4。

表1 涂片法檢測結果與臨床診斷比較

表2 L-J法檢測結果與臨床診斷比較

表3 MGIT 960法檢測結果與臨床診斷比較

表4 GeneXpert法檢測結果與臨床診斷比較

2.3 四種方法聯合檢測結果

涂片法+L-J法+GeneXpert法+MGIT 960法聯合檢測的敏感度（48.78%）最高，特異度（87.18%）最低，但四種方法聯合檢測的敏感度、特異度比較，差異無統計學意義（χ2=1.866、0.173，P=0.393、0.917＞0.05）。見表5。

表5 四種方法聯合檢測結果（%）

3 討論

肺結核作為一種法定傳染病，其危害人體多種器官，嚴重影響人們生活質量[9-10]。肺結核診斷的主要途徑為MTB檢測，國內“十三五”結核病防治規劃指出，肺結核患者病原學應達到50%陽性率[11]，而2017年國內《WS 288-2017肺結核診斷》中的病原學檢測范圍新增了MTB液體培養及核酸檢測。因此，尋找更佳的肺結核診斷方法十分重要。

涂片法為當前肺結核主要檢測方法，其操作簡便，檢測速度快，且易普及[12]。但涂片法要求標本中的含菌量較高，故其敏感度較低，單獨使用不利于臨床診斷。本研究中涂片法診斷的敏感度為36.59%（15/41）、特異度為89.74%（35/39），與王蔚等[13]報道的敏感度為36.41%、特異度為91.52%結果相似，均表明涂片法單用敏感度較低。眾多學者認為結核病實驗室檢查診斷的“金標準”為MTB培養，如L-J法、MGIT 960法。L-J法培養的檢出率雖高，但其耗時長，不利于肺結核的早期診斷，且該法操作繁瑣，操作過程中有污染風險，可能導致結果呈假陰性，易加重患者病情[14]。本研究中，L-J法診斷的敏感度為31.71%（13/41）、特異度為94.87%（37/39），提示L-J法診斷肺結核的敏感度較低，特異度較高。MGIT 960法最早為美國BD公司提出，相比L-J法，其優化接種前操作步驟（如中和離心集菌等），進而提高MTB培養陽性率，同時其去污染試劑更溫和高效，并且其將熒光底物加入專用培養管中，方便觀察細菌生長，進一步縮短結果判斷時間[15-16]。代小偉等[17]報道，MGIT 960法診斷肺結核患者的敏感度為43.2%，特異度為95.1%。本研究中，MGIT 960法診斷的敏感度為43.90%（18/41）、特異度為92.31%（36/39），其檢測的敏感度最高，與上述研究一致。早在2010年世界衛生組織即推薦使用GeneXpert法進行MTB檢測，該法主要為半巢式定量PCR診斷技術，其將rpoB基因利福平耐藥核心區間的81 bp片段作為靶序列，以檢測其是否發生突變[18]。GeneXpert法能夠在2 h內迅速得出檢測結果，判斷MTB及利福平的耐藥性，有助于雙重感染患者的早期抗結核治療[19]。本研究中，GeneXpert法判斷的敏感度為39.02%（16/41）、特異度為100.00%（39/39），其檢測特異度比涂片法、L-J法、MGIT 960法高，與周喜桃等[20]報道相似，提示GeneXpert法診斷肺結核特異度極高。

據相關研究報道，將不同實驗室檢查方法進行聯合檢測可以提高檢測敏感度[21]。為此，本研究以本院實際情況為依據，將涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法四種檢測方法進行三種組合的聯合檢測。本研究結果顯示，涂片法+L-J法聯合檢測的敏感度為34.15%，比單獨應用涂片法檢測的敏感度低；涂片法+L-J法+GeneXpert法聯合檢測的敏感度為43.90%，高于三種方法單獨檢測的敏感度；涂片法+L-J法+GeneXpert法+MGIT 960法聯合檢測的敏感度高達48.78%，提示四種方法聯合檢測可以顯著提高診斷的敏感度。但四種檢測方法聯合檢測的敏感度、特異度比較無統計學差異，這可能與本研究樣本量較少有關。有學者認為MGIT 960法不僅操作繁雜，還對操作人員及操作環境有較高要求，不適用于臨床大范圍開展。另外，有學者認為在結核病病原學檢測中，應將傳統涂片法與培養法剔除，采用MGIT 960法、GeneXpert法等代之。本研究認為，實驗室檢測條件不同，各種檢測方法的地位亦不同，故其不可相互取代；并且MGIT 960法亦有自身優點，如耗時短、陽性標本可供后續研究等，故有條件的實驗室可積極開展；同時涂片法、L-J法、GeneXpert法、MGIT 960法可以聯合檢測以最大優化診斷效能，提高檢出率，減少或避免漏診，更好為患者服務。

綜上所述，涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法檢測在疑似肺結核患者臨床診斷中的應用效果較好，其中MGIT 960法檢測的敏感度最高，GeneXpert法檢測的特異度最高，而四種方法聯合檢測可以有效提高檢測的敏感度。