紡織品中白假絲酵母菌快速鑒定方法的研究

李 軻 禹建鷹 李傳民 傅科杰 郭會清

（1.鄭州海關，河南鄭州，450003；2.河南捷信檢測認證有限公司，河南鄭州，450003；3.寧波檢驗檢疫科學技術研究院，浙江寧波，315000）

白假絲酵母菌是最常見的致病性假絲酵母菌，是一類致病性、侵襲性強的深部感染真菌［1］。臨床研究中，白假絲酵母菌感染會引起人體皮膚、黏膜及內臟的急、慢性炎癥等［2?3］，且病死率高［4?7］。筆者團隊通過對紡織品生物安全的多年跟蹤研究，認為白假絲酵母菌是紡織品污染重點關注對象［8］。前期研究中，根據白假絲酵母菌菌落特征已建立相應定性、定量傳統方法［9］，在傳統方法基礎上，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（以下簡稱MALDI?TOF MS）技術代替傳統生化，構建了白假絲酵母菌快速定量檢測方法［10］。研究發現，假絲酵母菌為單細胞酵母型真菌，菌落形態與一般細菌相似，通常假絲酵母菌為具有酵母相和菌絲相雙相菌［11?12］，因此傳統的分離培養和涂片鏡檢鑒別白假絲酵母菌容易造成假陰性結果。在前期研究的基礎上，本研究選取假絲酵母菌屬高度保守基因5.8S核糖體RNA基因（以下簡稱5.8SrDNA）設計假絲酵母菌通用引物，構建出假絲酵母菌實時熒光PCR初篩模型，初篩提示陽性時，采用MALDI?TOF MS技術鑒定確認，從亞種水平上對假絲酵母菌進行分類，達到簡單、快捷和有效的鑒定白假絲酵母菌的目的。該研究可作為我國應對紡織品白假絲酵母菌污染突發公共衛生事件技術儲備，預計在公共衛生和疫情防控中發揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

白假絲酵母菌ATCC 10231、近平滑假絲酵母菌ATCC 22019、光滑假絲酵母菌ATCC 15126、熱帶假絲酵母菌ATCC 1369、沙門氏菌CICC 21493、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、綠膿桿菌ATCC 10145、單增李斯特菌CMCC 54002、阪崎腸桿菌IQCC 10403、副溶血性弧菌ATCC 10782、大腸桿菌CMCC 44102、大腸桿菌O157 ATCC 700728。

1.2 主要試劑、儀器

WORT肉湯、BIGGY瓊脂、BHI肉湯，青島海博生物科技有限公司；標準溶劑（乙腈50%+水47.5%+三氟乙酸2.5%），Sigma?Aldrich公司；質譜樣品處理基質，布魯克公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；FastFire快速定量PCR試劑（探針法），天根生化科技（北京）有限公司。BioSpec?nano超微量分光光度計，日本島津公司；CFX96熒光PCR儀，美國伯樂公司；MALDI Biotyper微生物快速鑒定系統，德國布魯克公司。

1.3 分子方法

1.3.1 增菌培養

將白假絲酵母菌ATCC 10231、近平滑假絲酵母菌ATCC 22019、光滑假絲酵母菌ATCC 15126、熱帶假絲酵母菌ATCC 1369接種WORT肉湯，25℃需氧培養；其他菌株接種BHI肉湯37℃需氧培養。觀察各培養物渾濁即可。

1.3.2 DNA提取

取1.3.1肉湯培養物1 mL～2 mL，4℃下12 000 r/min、15 min離心收集，前處理用玻璃珠，再用硅質膜吸附，即可得到高純度的基因組，具體操作按真菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進行。提取的DNA片段用超微量分光光度計檢測濃度與純度后密閉存放于-20℃保存備用。

1.3.3 引物、探針設計及優化

從EMBL核酸序列數據庫中提取帶注釋的假絲酵母菌5.8SrDNA序列，利用Clustal Omega進行多重比較、分析。篩選出保守區域設計假絲酵母菌的通用引物和探針。primer blast檢驗引物特異性。正向引物5.8S?QF1：5′?AACGCAGC?GAAATGCGATAC?3′。反向引物5.8S?QR1：5′?GACATCACGCTCAAACAGGC?3′。探針5.8S?P1：FAM?5′CATTGCGCCTTGGGG?TATTC3′?TAMRA。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3.4 熒光PCR體系建立

反 應 總 體 系25μL，2×Fastfire qPCR Pre?Mix 12.5μL，正、反 向 引 物（10μmol/L）各0.75μL，探針（10μmol/L）0.5μL，模板DNA（20 ng/μL～200 ng/μL）2μL，其 余 用RNase?Free dd H2O補足。反應條件：98℃、1 min預變性，95℃、5 s變性，60℃、15 s退火/延伸，共40個循環。

取1.3.2提取的假絲酵母菌DNA，采用1.3.3設計的引物和探針，設定模板上樣量為0.5μL、1.0μL、2.0μL、3.0μL、4.0μL，對模板上樣量進行優化，選取最適模板上樣量；退火溫度一般在55℃～70℃之間，先根據設計引物的GC量估算引物溶解溫度（T m），估算后兩條引物的T m值差異不大，以最低T m低于5℃為PCR反應退火溫度起始，以2℃為梯度，設定56℃、58℃、60℃、62℃、64℃進行優化，確定最適退火溫度。每次試驗重復3個平行試驗。

1.4 M ALDI?TOF MS鑒定

1.4.1 菌株分純

取1.3.1肉湯培養物劃線接種BIGGY瓊脂，25℃需氧培養48 h。

1.4.2 菌落蛋白提取

用無菌棉簽挑取約5 mg菌落放入裝有300μL去離子水的1.5 mL EP管中，混勻；再取900μL無水乙醇加入，振蕩混勻；12 000 r/min離心2 min，吸棄上清，室溫下放置2 min；再向管中加入50μL 70%甲酸水溶液，混勻；再加入50μL純乙腈混勻，12 000 r/min離心2 min；吸取上清液轉移到新EP管中備用。

1.4.3 點靶

吸取1μL 1.4.2提取好的菌落蛋白，按試驗布控順序滴加到MALDI靶板測試點位（每個靶板有96個測試點位）上，室溫下晾干；取出質譜樣品處理基質，恢復室溫后加入250μL標準溶劑，渦旋振蕩器混勻至完全溶解，離心，每個點位加1μL基質溶液，室溫下自然蒸發溶劑。

1.4.4 MALDI?TOF MS數據采集分析

采用MALDI Biotyper微生物快速鑒定系統采集數據，正線性模式，采集蛋白圖譜質量范圍2 000 D～20 000 D，激光轟擊點數100，加速電壓20 k V，提取時間150 ns。每次試驗前均用校準肽蛋白（質量范圍2 000 D～20 000 D）進行質量校正。

將1.4.3靶板放入儀器，開啟Flex Con?trol3.4軟件采集細菌質譜數據，自動分析得到蛋白峰信息。打開MALDI Biotyper3.1軟件，選擇數據庫，調入上述細菌質譜數據，分析樣品譜圖與庫中標準特征譜圖匹配程度。

1.5 特異性驗證

1.5.1 熒光PCR特異性驗證

取1.3.2提取的DNA，按照1.3.4優化好的PCR體系及擴增條件進行特異性驗證，每個模板重復3次平行試驗。

1.5.2 MALDI?TOF MS特異性驗證

取1.4.1分純好的菌落，按照1.4.2提取蛋白后，進行MALDI?TOF MS鑒定，每個試驗重復3次平行試驗。

1.6 靈敏度驗證

取1.3.1增菌后的假絲酵母菌菌液各1 mL制成混合菌液，取混合菌液1 mL稀釋至108級，各取106級、107級、108級稀釋度1 mL菌液涂布接種BIGGY瓊脂平板，25℃需氧培養48 h后計數平板上菌落數，計算出每個稀釋度的細菌濃度。取104級、105級、106級、107級、108級稀釋度菌液提取基因組DNA進行擴增驗證熒光PCR方法靈敏度，每個稀釋度重復3次平行試驗。

1.7 重復性驗證

1.7.1 樣品制作

收集130份不同來源、不同材質的紡織品樣品（醫院護士服、病房床上用品各10份，酒店浴巾、床上用品各10份，火車臥鋪床上用品10份，飛機公用毛毯5份，照相館衣服、毛絨玩具各10份，捐贈衣物25份，試驗用防護服、隔離衣、一次性口罩各10份），依據標準SN/T 4656.1—2016《進出口紡織品生物安全檢驗方法第1部分：白假絲酵母菌》檢測白假絲酵母菌，21份樣品檢測出白假絲酵母菌。109份白假絲酵母菌陰性的樣品，按SN/T 4656.1—2016 6.1制樣，取1.6中105級稀釋度假絲酵母菌菌液，分別加入制作好的樣品中，每個樣品1 mL，混勻隔夜放置。

1.7.2 樣品驗證

對109份人工污染樣品按上述方法進行PCR擴增和MALDI?TOF MS鑒定，同時用SN/T 4656.1—2016第7節平行檢測。

對21份自然污染樣品按上述方法進行PCR擴增和MALDI?TOF MS鑒定。

2 結果分析

2.1 DNA純度結果

提取的DNA最后會殘留有蛋白質、鹽和小分子物質，DNA鏈上堿基的苯環結構在260 nm處吸收峰最大，蛋白質在280 nm吸收峰最大，鹽和小分子在230 nm吸收峰最大。因此，本試驗用紫外分光光度計同時檢測DNA的OD260、OD280和OD230值，利用其比值來衡量DNA的純度，見圖1。OD260/OD280為1.87，適中；OD260/OD230為1.29，偏低，可能是洗脫時用去離子水代替了洗脫緩沖液造成比值偏低，但并不表明DNA純度不高。

圖1 DNA濃度和純度結果

2.2 熒光PCR反應體系優化

2.2.1 模板上樣量優化

模板上樣量優化結果見圖2。從圖2不同上樣量的擴增結果中可以看出，當上樣量在0.5μL～2.0μL時，特異性和敏感性幾乎不受影響，擴增效率保持穩定，S型擴增曲線比較明顯，但當模板量較高時，敏感性和擴增效率相應降低。因此，最佳上樣量應選擇為0.5μL～2.0μL。

圖2 模板上樣量優化結果

2.2.2 退火溫度優化

退火溫度優化結果見圖3。退火溫度較低（56℃）時，理論上能夠保證引物和目的序列有效退火，但同樣會產生非特異性結合影響擴增效率；退火溫度過高（64℃）同樣影響引物和模板間的結合效率。因此在Tm值合適范圍內，退火溫度選擇PCR反應特異性強、擴增效率最高的溫度點（60℃）。

圖3 退火溫度優化結果

2.3 特異性結果分析

2.3.1 熒光PCR特異性驗證

熒光PCR特異性驗證結果見圖4。只有假絲酵母菌出現S形典型陽性擴增曲線，其他非假絲酵母菌未收集到熒光信號，說明該試驗引物特異性高，符合試驗要求。

圖4 熒光PCR特異性驗證結果

2.3.2 MALDI?TOF MS特異性驗證

取BIGGY瓊脂平板上具有假絲酵母菌特征菌落進行MALDI?TOF MS特異性驗證。典型及可疑假絲酵母菌用MALDI?TOF MS鑒定，分析出不同質譜譜峰，成功得出白假絲酵母菌特征譜圖，見圖5。

圖5 假絲酵母菌質譜鑒定圖譜

2.4 靈敏度結果分析

混合菌液各濃度接種BIGGY瓊脂平板培養后計數，107級平板計數結果為40 CFU，依次推斷104級、105級、106級、107級、108級濃度計數結果理論值分別為4×104CFU/mL、4×103CFU/mL、400 CFU/mL、40 CFU/mL、4 CFU/mL，熒 光PCR擴增后結果見圖6。當菌液濃度理論值為4 CFU/mL時，熒光信號很弱，擴增曲線不明顯，因此本試驗靈敏度約為40 CFU/mL。

圖6 熒光PCR靈敏度結果

2.5 重復性結果分析

2.5.1 人工污染樣品結果

109份不同來源、不同材質的紡織品樣品，人工污染后進行PCR擴增和MALDI?TOF MS鑒定，同時用SN/T 4656.1—2016第7節平行檢測，結果熒光PCR擴增全部陽性，見圖7，質譜鑒定也全部陽性，結果和SN/T 4656.1—2016第7節檢測100%相符。

圖7 人工污染樣品熒光PCR結果

2.5.2 自然污染樣品結果

對21份檢測白假絲酵母菌為陽性的自然污染樣品增菌后提取DNA，熒光PCR擴增結果全部陽性，見圖8，分離后MALDI?TOF MS鑒定結果均為陽性，與SN/T 4656.1—2016第7節檢測完全一致。而SN/T 4656.1—2016測出陽性需要9天～10天，本方法3天即可出結果，檢測效率提高了3倍。

圖8 自然污染樣品熒光PCR結果

3 討論分析

本研究針對紡織品中白假絲酵母菌，采用實時熒光PCR技術結合MALDI?TOF MS技術，構建出初篩模型并指引了最終鑒定方法。白假絲酵母菌是一種雙相態菌，受不同生存環境影響，酵母相和菌絲相可以互相轉變，隨著形態的轉變，其毒力基因很容易發生突變或基因交流［13］，因此，以毒力基因為靶基因設計引物，特異性和靈敏度很難得到理想效果。目前，常用的假絲酵母菌分類基 因 有5.8SrDNA、beta?tubulin、28SrRNA、5SrRNA、18SrRNA等［14］。而5.8SrDNA在假絲酵母菌種內不同菌株之間高度保守［15］，更適合假絲酵母菌種屬鑒定。本研究從GeneBank數據庫中提取假絲酵母菌5.8SrDNA基因序列，利用Clustal Omega軟件設計出針對紡織品假絲酵母菌的實時熒光PCR通用引物，經驗證4種常見假絲酵母菌均能特異性擴增，而其他幾種非假絲酵母菌屬均未見特異擴增，適合假絲酵母菌初篩鑒定。初篩后采用MALDI?TOF MS技術鑒定，結果和傳統方法完全一致，而檢測效率提高了3倍。MALDI?TOF MS技術是一種基于強大數據庫的軟電離生物質譜技術，廣泛用于病原菌分型鑒定，具有高自動化、高通量、高靈敏度等特點。另外本研究選用了針對假絲酵母菌選擇性較強的WORT肉湯增菌、BIGGY瓊脂分離純化菌落，對以上結果有一定的貢獻。

4 結論

本研究應用實時熒光PCR技術結合MALDI?TOF MS技術，創新建立了一種快速、高效鑒定紡織品中白假絲酵母的方法，經驗證靈敏度可達40 CFU/mL，通過對人工污染樣品和自然污染樣品檢測，結果和傳統方法100%符合。該方法將兩種成熟應用的技術相結合，可操作性強，便于推廣應用，為快速、準確鑒定白假絲酵母菌打開了新思路。

雖然PCR技術和MALDI?TOF MS技術在各領域應用相對成熟，但兩者標準化程度并未同步，而且相差甚遠，PCR技術標準化程度相對較高，MALDI?TOF MS技術目前只能搜索到標準GB/T 33682—2017《基質輔助激光解析電離飛行時間質譜鑒別微生物方法通則》。MALDI?TOF MS技術依賴其強大的已知菌株譜圖庫，而其大部分數據庫沒有我國自主知識產權，這也是該技術難以完全標準化的主要原因，而白假絲酵母菌基因易變異、重組，未知太多，鑒定準確率必須要有大數據支撐，后續可深入研究，通過自建假絲酵母菌譜圖庫補充、完善現有數據庫。相信隨著對MALDI?TOF MS技術深入研究，越來越多的相關成果會實現資源共享、數據共享，實現MALDI?TOF MS技術完全標準化。