碳酸酐酶9在腎細胞癌中的表達對預后評估的價值不足：一項基于TCGA生物信息學分析的Meta分析

張子寬，邵 淵，陳勇全，吳 波，王東文

(山西醫科大學第一醫院泌尿外科，山西太原 030001)

腎腫瘤(renal cell carcinoma，RCC)是人類最常見的實體腫瘤之一，近年來發病率迅速上升[1]。2020年美國有73 750例新發腎腫瘤患者，同時有14 830人因腎腫瘤死亡[2]。腎腫瘤經常發生缺氧和壞死，腫瘤缺氧已被證明是患者預后不良的獨立因素[3]，其可削弱手術、化療、放療等治療方式的療效[4]。因此，許多研究試圖量化腫瘤缺氧程度，并對其精確測量以預測治療效果[5]。

基于組織的RCC生物標志物的檢測可能有助于預測術后疾病的進展和對輔助治療的反應[6]。碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9，CA9)也稱MN蛋白，已被作為預測RCC術前或術后結局的生物標志物[7]。與正常腎組織相比，CA9在RCC中表達水平較高[8]，而在正常腎臟中不表達，因此被認為是一種很好的潛在組織生物標志物。其主要功能是通過反應：CO2+H2O=HCO3-+H+來維持細胞內外pH之間的平衡，從而產生酸性的細胞外微環境[9]。CA9作為一種缺氧相關蛋白，其高表達與頭頸部腫瘤[10]、卵巢腫瘤[11]的低氧狀態和不良臨床結果有關。圍繞RCC，已有報道稱高CA9表達與良好的預后相關[12-21]。但也有研究認為CA9的表達與RCC預后無相關性[22-23]。CA9的研究產生了矛盾的結果，因此我們進行Meta分析以確定CA9是否可以作為RCC的預后指標。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索、納入標準及數據提取在PubMed、Cochrane圖書館和Web of Science數據庫中檢索關鍵詞：renal or kidney;cancer or carcinoma or tumor or neoplasm；“carbonic anhydraseⅨ” or “CAⅨ” or “CA9”,以及prognosis or survival，對CA9在RCC預后中的作用的文獻進行初步文獻檢索。發表文章時間截至2020年12月。文獻納入標準：①經組織病理學證實的腎細胞癌診斷；②采用免疫組織化學染色法(immunohistochemistry，IHC)檢測原發性腎癌組織CA9水平。本研究主要評價經手術治療的腎腫瘤的預后與CA9表達的關系，未行手術者則排除。當同一患者隊列被多篇論文報告時，患者數量最多的報告被納入本研究。

由邵淵和吳波2位研究員提取的數據包括納入文獻的基本信息(第一作者、發表年份、作者國家和病例數)、腫瘤特征(腫瘤分期和分級)、CA9表達強弱分界值、生存結局(CA9表達相關生存)。

從PubMed、Web of Science和Cochrane數據庫中，分別檢索出493、318和97篇(共908篇)可能與本研究相關的文章。使用Endnote軟件后，排除125篇重復論文。閱讀標題和摘要，有71篇論文可用于評估RCC患者CA9表達水平與預后的相關性。我們的Meta分析共包括27項研究[12-21,24-40]，其中包括12篇新的研究[25-35,40]，是在最近5年(2014年之后)發表的。

我們的Meta分析共納入了5 462例患者。這些研究中，有9項采用多變量分析進行評估，18項采用單變量分析進行評估。疾病特異性生存率(disease-specific survival，DSS)、總生存率(overall survival，OS)、無進展生存率(progression-free survival，PFS)和無復發生存(recurrence-free survival，RFS)分別有9、15、7、6項研究報道。納入研究的評估質量和基本信息見表1。

1.2 數據分析采用危險比(hazard ratio，HR)及其95%置信區間(confidence interval，CI)的危險比描述CA9表達高低對患者生存的影響。當研究中提供HR和95%CI時，直接提取這些數據進行分析。如果文獻沒有提供數據，則使用EngaugeDigitizer軟件(4.1版)從Kaplan-Meier生存曲線中估計HR值和95%CI，并從曲線中提取存活率，得到HR(SE)值[41]。數據分析采用Stata11.0軟件。此外，Q檢驗和I2指數被用于評估研究的異質性。當被分析的數據具有明顯的異質性時，采用隨機效應模型[24]，反之采用固定效應模型。所有統計檢驗均為雙側，當P<0.05時，差異具有統計學意義。

1.3 質量評價所有納入分析的研究都是由2位獨立的評審員進行質量評估，使用Newcastle-Ottawa質量評估量表進行評估(http:∥www.ohri.ca/programs/clinical_epidemiology/oxford.asp)。研究質量評估主要分為3部分：①隊列的選擇；②隊列的可比性；③結果的準確性。評價表共有8個項目。當研究在第1和第3部分中具有較高質量時，得1分。在第2部分中，文獻有較高質量得2分。然后將總分加在一起，得出總評分進而比較文獻質量。

1.4 發表偏倚用Egger檢驗，Begg檢驗和漏斗圖來評估發表偏倚的風險。

1.5 TCGA數據集RCC的臨床信息來源于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數據門戶。包括588例具有可用臨床信息的病例和72例正常組織樣本。

2 結 果

2.1Meta分析結果

2.1.1在RCC中CA9表達水平與DSS無關 首先，我們先進行了包括所有研究在內的分析，結果表明CA9的表達水平與DSS無關(HR=1.18，95%CI：0.82～1.70，I2=79.3%，P<0.05，圖1A)。然而，異質性較為明顯，因此我們通過排除低質量文獻后再進行亞組分析，在只包括高質量文章的亞組分析中結果仍然和前述分析類似(HR=1.40，95%CI：0.89～2.18，I2=39.0%，P=0.161，圖1B)。最后，我們又進行了一次只包含較新研究的亞組分析(HR=0.95，95%CI=0.51～1.78，I2=1.1%，P=0.364，圖1C)，結果也顯示CA9的表達高低與DSS沒有關系。

表1 納入研究的27項研究的基本信息和質量評估

A：納入所有研究；B：排除低質量研究后；C:只包含較新研究。

2.1.2CA9表達水平不能預測RCC患者的術后OS 按照前述的方法，我們對CA9表達與OS之間進行了幾個亞組分析，共包括15項研究來評估CA9表達與OS之間的相關性。結果表明CA9表達與OS無關(HR=1.13，95%CI：0.82～1.56，I2=79.8%，P<0.05，圖2A)。顯著的異質性使我們也需要有像圖1B這樣的亞組分析。在排除低質量研究后，結果仍然沒有變(HR=0.90，95%CI：0.75～1.07，I2=23.1%，P=0.246，圖2B)。正如預期的那樣，數據支持CA9表達與OS沒有相關性。在只包括新研究的亞組分析中也有相同的結果(HR=0.94，95%CI：0.63～1.40，I2=80.9%，P<0.05，圖3A)，但結果存在顯著的異質性，因此我們有一個額外的分析，低質量的研究(質量評分≤6)被刪除，以減少異質性。得出了與之前相同的結果(HR=0.83，95%CI：0.68～1.01，I2=33.1%，P=0.201，圖3B)。

A：包括所有研究；B：排除低質量研究后。

A：包括所有新研究；B：只包括高質量新研究。

2.1.3RCC中CA9表達水平與PFS無關 由于缺乏新研究(只有2項2015年后的研究)，CA9和PFS之間的分析比以前的分析更簡單，因此我們只進行了包括所有研究在內的分析，不包括低質量的研究。分析共包括7項研究(HR=1.73，95%CI：0.97～3.09，I2=82.4%，P<0.05，圖4A)，結果表明高CA9表達與PFS升高有關。這些結果可能與納入較少的新文獻有關。隨后我們進行了亞組分析來減少異質性，在排除低質量研究后，發現結果仍然與前面幾項分析的結果類似(HR=1.04，95%CI：0.79～1.36，I2=0.0%，P=0.465，圖4B)。

2.1.4RCC中CA9表達水平與RFS無關 我們還比較了CA9和RFS之間的關系。與其他分析一樣，我們也沒有發現CA9和RFS之間的關系。因為只有較新的研究有相關的數據，所以只進行了包括新研究的分析(HR=0.99，95%CI：0.95～1.02，I2=57.8%，P=0.050，圖5A)。該項分析的異質性也很顯著，所有納入研究質量評價均在6分以上，其中5項評為8分，只有1項研究評為7分。因此，進行了一個不包括最低質量研究的亞組分析(HR=1.01，95%CI：0.99～1.03，I2=0.00%，P=0.704，圖5B)。無論是圖6A還是圖6B，CA9表達與RFS沒有相關性的結果仍然是穩定的。

A：包括所有研究；B：只包含高質量研究。

2.1.5發表偏倚 本研究的發表偏倚使用漏斗圖和Egger檢驗、Begg檢驗評價。對于OS的分析，漏斗圖顯示存在發布偏倚(圖6A)。發表偏倚通過Egger檢驗和Begg檢驗進行測定(Egger’stest=0.040,Begg’stest=0.921)，排除低質量研究后，發表偏倚明顯減少(Egger’stest=0.160,Begg’stest=0.902，圖6B)。其余各項分析結果均與前述結果相似，圍繞CA9與OS，僅包括新研究(Egger’stest=0.328,Begg’stest=0.536，圖6C)，排除低質量文獻后(Egger’stest=0.844,Begg’stest=1.000，圖6D)；圍繞CA9與PFS的發表偏倚檢驗(Egger’stest=0.308,Begg’stest=0.764，圖6E)，排除低質量文獻后(Egger’stest=0.183,Begg’stest=1.000，圖6F)；圍繞CA9與RFS的發表偏倚檢驗(Egger’stest=0.225,Begg’stest=0.462，圖6G)，排除低質量文獻后(Egger’stest=0.710,Begg’stest=1.000，圖6H)；圍繞CA9與DSS的發表偏倚檢驗(Egger’stest=0.771,Begg’stest=0.466，圖6I)，排除低質量文獻后(Egger’stest=0.262,Begg’stest=0.548，圖6J)；只包括新研究(Egger’stest=0.666,Begg’stest=1.000，圖6K)。CA9與不同生存指標的分析結果均可接受。

2.2 TCGA生物信息學分析為了驗證上述結果，我們對CA9與各種生存率相關性進行了生物信息學分析。其結果與前述的分析一致。圖7A～C顯示，所有生存率均有相似的結果，即低CA9表達與高CA9表達之間的生存率沒有差異。對TCGA數據的分析表明，腎癌CA9的表達水平高于正常組織。在核分級和病理分期方面也未發現各組之間有顯著差異。再進行生存分析，發現CA9的表達與無疾病生存率(disease-free survival，DFS)(P=0.3，圖7A)、OS(P=0.073，圖7B)、DSS(P=0.204，圖7C)無關。

A:CA9的表達與患者DFS的生存曲線；B:CA9的表達與患者OS的生存曲線；C:CA9的表達與患者DSS的生存曲線。

3 討 論

CA9的表達在腫瘤診斷、治療和臨床結果預測方面已有多種應用。有些疾病如乳腺癌，可以通過檢查HER2在根治性手術后的表達來有效地預測預后[42]。因此很多研究者正在尋找類似的生物標志物來預測RCC患者的生存情況。

納入的27篇論文中可供分析的數據包括CA9的表達與DSS、OS、PFS、RFS的相關性。我們的分析表明CA9的表達高低與不同的生存率均無相關性。CA9表達與患者預后的相關性在其他的腫瘤中已被證實：如CA9在頭頸部[10]、乳腺[43]、食管[44]、胰腺[45]和軟組織腫瘤[46]中表達，且這些腫瘤預后差均與CA9的高表達有關。腎腫瘤中CA9的表達則有所不同。除了癌細胞林島綜合征(von-hippel-lindau，VHL)基因及其所產生蛋白影響CA9的表達外，也有報道稱PI3K和未折疊蛋白反應也有調節作用[47]，這增加了CA9的表達和RCC預后的不確定性。除RCC外，在卵巢癌[48]、膀胱癌[49]和宮頸癌[50]的研究中也顯示CA9水平與患者預后無相關性。除了上述腫瘤，還有一些存在爭議的，如腦腫瘤，不同的研究中CA9與腦腫瘤的OS和PFS結果存在矛盾[51-52]。

在大多數RCC中，特別是腎透明細胞癌(clear cell RCC，ccRCC)有個獨特的特征，即癌細胞VHL基因突變頻繁發生[53]。有研究表明，在低氧條件下，CA9表達對HIF-1α有依賴性[54]。HIF-1反應元件HRE定位于CA9轉錄起始位點旁邊[11]，提示CA9是HIF-1下游靶基因。當腫瘤處于低氧條件時，缺氧誘導因子-1α(hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)(HIF有2個部分，一個固有型β-亞基和一個氧敏感的α亞基[55])不能被脯氨酸羥化酶結構域蛋白羥化，且由于VHL基因突變而被異常的VHL蛋白包圍[56]，HIF-1α不能被26S蛋白酶體降解而持續存在[57]。這一情況導致HIF-1α的持續積累和激活[58]。在低氧狀態和酸性條件下，CA9的表達由HIF轉錄復合物介導[59]。在文獻中，由于VHL基因突變導致HIF-1α非氧濃度依賴性積累導致CA9異常增加，使其不能反映真實的低氧狀態，這可能使CA9表達與患者預后相關性出現偏差。CA9在RCC中的表達可歸因于VHL蛋白阻止CA9在常氧時的蛋白酶體降解，并在無氧或缺氧[60]的情況下表達。綜上所述，VHL基因突變導致VHL蛋白缺失，不能降解HIF-1α致使HIF-1α的異常積累。在正常或低氧條件下，HIF-1α可調節CA9過表達，通過檢測CA9表達水平無法反映腫瘤缺氧，也無法預測患者預后。

目前還沒有研究表明CA9表達在腎癌不同治療方式中是否有顯著差異。我們沒有評估CA9表達與T、N、M和Furhman核分級之間的關聯，因為2014年后沒有新的研究報告關于它們的完整數據，并且在2014年的一項研究中CA9水平與T之間的關聯已經被證明無關[7]。在我們的分析中，納入所有研究的分析和只包括高質量研究的亞組分析均得出結論認為CA9不能作為預測RCC預后的生物標志物。

與幾年前的Meta分析相比，我們納入了更多的文獻，得出了更科學的結論。除了DSS、OS和PFS之外，我們還評估了CA9與RFS的相關性。為了使結論更可靠，我們采用生物信息學分析來驗證結論。

本研究也有局限性，例如觀察性研究低于隨機對照試驗提供的證據水平。我們的Meta分析中包含的大多數研究都是回顧性研究。本研究中，27項納入的研究之間存在顯著的異質性。與以往的Meta分析[7]相比，我們沒有限制文獻語言，因此得到了更完整的文獻檢索[41]。異質性可能是由以下因素引起的，如來自不同國家的患者具有不同的腫瘤分期和組織學類型，對CA9表達高低的定義，使用的治療方法，隨訪時間，不同來源和稀釋的抗體等。為了盡量減少異質性，只選擇用IHC測量CA9表達水平的研究。此外，我們需要注意發表偏倚。對于OS，結果存在發表偏差(圖6A、C)。但當排除低質量的研究后，發表偏倚明顯降低(圖6B、D)。此外，RFS和DSS沒有顯著的發表偏倚(圖6H、K)，這表明分析結果是可信的。另一個限制是數據提取的過程，當文獻中不直接提供HR和SE時，使用生存曲線計算所需數據。該過程不可避免的引入了潛在的異質性來源。估計的HR和SE可能不如研究直接提供的準確。當我們使用TCGA數據庫進行生信分析時，由于數據庫中缺乏患者RFS和CA9的相關數據，我們只能使用DFS。

我們的Meta分析表明，IHC檢測到的低CA9和高CA9表達之間沒有發現各種生存率的差異。