生姜蛋白酶基因的克隆及在原核細胞中的表達

盧瑛

摘 要：提取萊蕪生姜總RNA，采用RT-PCR技術擴增出生姜蛋白酶（Ginger protease）基因GP2和GP3，經序列比對，發現萊蕪生姜蛋白酶基因GP2在945位的堿基與Gene bank中生姜蛋白酶的序列GP2b（GI：57118006）有差異，GP3在451、700和804這3個位置的堿基與GP3b（GI：57118011）有差異，在翻譯后的氨基酸也不同，表明了不同生姜品種生姜蛋白酶基因的多樣性。將克隆的GP2片段GPII重組到帶有His-tag的原核表達載體pET30a（+）中，構建重組表達載體pET-GPII。將重組pET-GPII轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中構建工程菌株，工程菌株用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達，在誘導6 h，IPTG濃度為0.1 mmol/L時，重組GPII表達量最高。SDS-PAGE凝膠電泳分析結果表明蛋白大小約為21 kDa。該實驗結果表明生姜蛋白酶能夠在原核表達系統進行大量表達，為生姜蛋白酶工程化生產奠定了基礎。

關鍵詞：萊蕪生姜;生姜蛋白酶;克隆;原核細胞;表達

生姜蛋白酶（Ginger protease/Zingibain，EC 3.4.22.67）是存在于生姜塊狀根莖中的一種巰基蛋白酶，有兩種GP-I和GP-II（GPI和GPII分別與GenBank中GP3和GP2同源性較高），均含有221個氨基酸，含有6個Cys形成3個二硫鍵為糖蛋白，具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能夠水解膠原蛋白，可用于肉類嫩化、酒類澄清，乳制品凝固等[1]，以姜汁為添加劑開發的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在廣東地區頗受歡迎，因此該酶具有良好的工業化應用前景[2]。

生姜蛋白酶的分離純化工藝操作復雜，而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品種、不同栽培地區及不同氣候條件下差異非常大，甚至同一品種的干姜與生姜之間的含量也不相同，導致生姜蛋白酶的提取率不穩定[3]。尤其生姜常年連作導致莖腐病、斑點病和姜瘟病高發，推升了市場上生姜的價格，使得提取生姜蛋白酶的成本升高，進一步限制了生姜蛋白酶的開發利用。

本實驗從萊蕪生姜中提取總RNA，通過RT-PCR技術擴增生姜蛋白酶基因，并構建了pET-GPII原核表達載體，重組質粒在大腸桿菌BL21中實現了原核表達，為生姜蛋白酶工程化生產進行了探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種、質粒和植物材料

大腸桿菌DHB4和宿主菌BL21以及質粒pET30a（+）為本實驗室保存，萊蕪生姜購于萊蕪大潤發超市。

1.1.2 酶、試劑盒和生化試劑

dNTP、DL2000、EasyTaq DNA聚合酶、TransStart FastPfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司;植物總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀有限公司;T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司;限制性內切酶KpnI、XbaI、EcoRI和反轉錄試劑盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit購自ThermoFisher公司;DNA凝膠回收試劑盒和DNA質粒提取試劑盒購自OMGEA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生姜蛋白酶cDNA的合成

根據植物總RNA提取試劑盒操作說明分離提取生姜總RNA，將RNA利用反轉錄試劑盒合成cDNA并稀釋至50 ng/?L。

1.2.2 引物的設計與合成

根據Gen Bank（NCBI）數據庫中生姜半胱氨酸蛋白酶基因GP2a（GI：57118005）和GP3a（GI：57118009）的上下游序列設計特異性引物，以生姜mRNA反轉錄產物（cDNA）為模板，PCR克隆生姜蛋白酶基因。兩對特異性引物，分別為GP2a上游引物：5-ATTAGGATCCATGGCTTCCACCGTAGACAAT-3，下游引物：5-ATTAAAGCTTTGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3;GP3a上游引物：5-ATTTGGATCCATGGCTTCCTTCGTCGC-3，下游引物：5-ATTAGTCGACTGCACTGCTCTTCAGACC-3;GPII上游引物：5-ATTAGAATTCGCTCCCTATCAGGATGTCCTGA-3，下游引物：5-ATTATCTAGATGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3。

1.2.3 生姜蛋白酶原核表達載體的構建

以稀釋后的cDNA為模板，PCR擴增生姜蛋白酶基因。PCR反應程序按照TransStart FastPfu DNA聚合酶說明書執行。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段。將回收的PCR產物交由上海桑尼生物科技有限公司進行測序，并與Gene Bank上已發布的序列進行比對。以GP2序列為模板克隆GPII片段，并連接到表達載體pET30a（+）載體上轉化感受態DHB4，經Kan+抗性的LB固體培養基篩選。挑取抗性重組子測序，將序列正確的克隆命名為pET-GPII。提取重組質粒轉化BL21感受態細胞。

1.2.4 生姜蛋白酶表達條件優化

將攜帶重組表達載體pET-GPII的工程菌BL21在LB培養基上培養至OD600為0.4時，分別加入0～0.5 mmol/L不同濃度的IPTG，37 ℃誘導4 h，并通過SDS電泳分析IPTG濃度對誘導結果的差異。進一步在加入0.1 mmol/L的IPTG條件下誘導0～10 h不等的時間，分析不同誘導時間對誘導結果的差異。

2 結果與分析

2.1 生姜蛋白酶基因的克隆與原核表達載體構建

通過RT-PCR成功獲得與目的基因大小相符的DNA片段。將該片段連接到原核表達載體pET-30a（+）并進行測序，GP2序列全長為1 146 bp，GP3為1 401 bp。序列比對發現與GP2與GP2b（GI：57118006）同源性為99.91%，僅在945位堿基發生改變，與GP2a（GI：57118005）相同位置的堿基一致。GP3與GP3b（GI：57118011）同源性為94.77%，有451、700和804這3個位置的堿基發生改變，與GP3a（GI：57118009）相同位置上的堿基一樣（如圖1所示），說明了不同品種生姜蛋白酶基因的多樣性。進一步以GP2為模板，克隆出了726 bp的GPII片段[4]，并將其連接到原核表達載體pET-30a（+）構建重組表達載體pET-GPII。

2.2 生姜蛋白酶的誘導表達及誘導條件優化

將重組表達載體pET-GPII轉化宿主菌BL21，培養單克隆菌落至OD600=0.4，然后添加IPTG，濃度為0.05 mmol/L，發酵1 h，4 h，6 h和10 h，以未添加IPTG的pET-GPII的菌和轉化空載體的菌為對照組，結果發現當誘導時間達到6 h以后，目的基因的蛋白表達量沒有顯著變化（圖2A）。當加入不同濃度的IPTG時，發現0.1 mmol/L的IPTG誘導表達的蛋白量最多（圖2B）;因此推斷最佳誘導條件為37 ℃，0.1 mmol/L，IPTG誘導6 h。

3 結論與討論

近年來隨著對生姜蛋白酶的深入研究，發現生姜蛋白酶對肉類具有良好的嫩化作用，對于酒類的澄清效率遠高于木瓜蛋白酶，還可作為凝乳劑來制作風味乳品。用生姜蛋白酶制備的奶酪，口感好，無苦澀感[5-6]，說明生姜蛋白酶具有潛在的商業應用價值。

原核表達系統具有遺傳背景清晰，細胞生長周期短，增殖速度快，發酵產量高，易于工程化等優點而受到歡迎，而且優化發酵條件可以使目的蛋白以可溶的形式生產。本研究成功克隆了生姜蛋白酶基因，并在原核表達系統中成功誘導表達，在37 ℃，0.1 mmol/L IPTG誘導條件下表達6 h產量最高。這為生姜蛋白酶工程化生產提供了理論基礎。

參考文獻

[1]馮敏，唐春紅.生姜蛋白酶的研究概述[J].中國食品添加劑，2008（6）：58-60.

[2]李田葉，李旻，安建樂，等.響應面法優化生姜蛋白酶提取及酸奶中的應用[J].食品工業，2015，36（7）：91-95.

[3]代景泉，黃雪松.生姜蛋白酶的分離純化[J].食品科學，2003（2）：73-79.

[4]MISOOK Kim，Hamilton S E.，Guddat L W.，et al.Plant collagenase：Unique collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger[J].2007，1770（12）：1627-1635.

[5]黃冬香，李小華，李林，等.生姜蛋白酶的研究進展及其在食品加工中的應用[J].食品工業科技，2009，30（12）：406-409.

[6]范金波，侯宇，黃訓文，等.生姜蛋白酶的分離、純化及酶學性質研究[J].食品與發酵工業，2014，40（5）：65-69.