改性黃腐酸/凹凸棒石復合材料的制備及其抑菌性能

楊芳芳，張 倩，宋亞萌，惠愛平，康玉茹，王愛勤

(1.中國科學院蘭州化學物理研究所，甘肅省黏土礦物應用研究重點實驗室，蘭州 730000；2.中國科學院蘭州化學物理研究所盱眙凹土應用技術研發中心，淮安 211700；3.蘭州大學第二醫院檢驗醫學中心，蘭州 730000)

0 引 言

在過去的半個多世紀，抗生素被大規模用于動物養殖業，在預防和治療動物傳染性疾病，促進動物生長及提高畜牧業經濟效益等方面發揮了重要作用[1-2]。然而，抗生素在養殖領域長期和過度使用造成了嚴重的細菌耐藥性及藥物殘留，對食品安全和公共衛生安全構成了威脅[3]。我國2020年7月起已全面禁抗。基于此，開發抗生素類促生長劑替代品迫在眉睫。

黃腐酸(fulvic acid, FA)又稱富里酸，是一類分子量較小、活性官能團豐富和藥用價值較高的復合有機酸。FA作為飼料添加劑，毒性較低[4]，能夠提高機體抗氧化能力[5]，可抑制和殺滅腸道內的病原菌，維持腸道微生物區系的平衡，從而增強機體對營養物質的消化吸收，提高免疫力，促進動物生長[6]。然而其廣譜抑菌性有待進一步提升。

凹凸棒石(attapulgite, APT)是一種天然的一維納米含水富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物。APT能夠促進腸黏膜修復，增強動物抗病能力[7-8]。APT獨特的棒晶形貌和孔道結構，既可以做功能復合抑菌材料的載體[9-10]，又可吸附抑菌活性成分，進而增強材料的抑菌性能[11-12]。為此，本文利用APT的吸附性能將FA負載于APT，同時采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)進行改性，獲得了具有一定廣譜抑菌性能的FA/APT復合抑菌材料。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

APT來自盱眙歐佰特粘土材料有限公司，其主要化學組成(質量分數)為Al2O310.73%，MgO 9.70%，CaO 0.49%，SiO260.83%，K2O 1.18%，Fe2O35.71%。FA來自山東創新腐植酸科技有限公司，純度為95%(質量分數)以上。CTAB購自成都市科隆化學品有限公司，分析純。金黃色葡萄球菌(S.aureus, ATCC25912)和大腸桿菌(E.coli, ATCC25922)由蘭州大學第二醫院提供，Luria-Bertani營養肉湯(LB)培養基和營養瓊脂(nutrient agar, NA)培養基均購自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 試驗儀器及測試方法

試驗儀器包括MS204TS電子分析天平、RT10多點磁力攪拌器、DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱、TDL-50C低速大容量離心機。傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜由Thermo Nicolet 6700型紅外光譜儀(波長為4 000～400 cm-1)測定，Zeta電位由ZEN3600 Zeta電位分析儀(633 nm He-Ne激光輻射)測定，復合材料的表面積和孔隙體積用ASAP2020全自動比表面積及微孔物理系吸附儀(N2，196 ℃)測定，熱重分析(TGA)在PerkinElmer STA 8000同步熱分析儀(N2氣氛，工作溫度為室溫至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min)上測定。

1.3 FA/APT復合材料制備

在300 r/min攪拌速率下，6個100 mL燒杯中分別加入20 mL去離子水和0.2 g FA粉末，完全溶解后再分別加入1 g APT粉末，分散完全后依次加入0.5%、1%、5%、10%、15%和20%(相對于APT質量)的CTAB。上述混合液攪拌5 min后超聲分散30 min，再繼續攪拌6 h后將混合液在轉速為4 000 r/min的離心機中離心10 min，用去離子水洗滌3次，60 ℃干燥12 h，研磨過200目(75 μm)篩，所得樣品依次標記為FA/APT-1、FA/APT-2、FA/APT-3、FA/APT-4、FA/APT-5和FA/APT-6。未經CTAB改性的樣品標記為FA/APT。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)評價

FA/APT復合材料抑菌性能評價采用最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)法[12]，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為代表革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的試驗菌株。平板中樣品的最終濃度如下：大腸桿菌組濃度為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL，金黃色葡萄球菌組濃度為1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL、0.01 mg/mL。最后用移液槍吸取1 μL的上述菌懸液(含菌量約為1×104CFU/mL)，點種于含待測樣品的瓊脂平板中，每個培養皿接種3個點。將所有平板移至恒溫培養箱中培養，在37 ℃下培養16～24 h后，觀察細菌生長情況，完全抑制菌落生長的最低樣品濃度為所得樣品的MIC值。試驗過程中建立不含樣品的陽性對照組和空白對照組。

2 結果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 紅外光譜分析

圖1 FA、APT、FA/APT復合材料的FT-IR譜和局部放大圖Fig.1 FT-IR spectra of FA, APT, and FA/APT composites and the partial enlarged detail

2.1.2 熱重分析

圖2是APT、FA/APT和不同濃度CTAB改性FA/APT復合材料的TGA和DTG曲線。由圖可見，對于APT，200 ℃以下的質量損失主要歸因于表面吸附水和沸石水的脫除，230 ℃和450 ℃左右的質量損失是由于配位水和結構水的脫除。FA/APT和CTAB改性后的FA/APT復合材料在70～90 ℃之間的質量損失同樣歸因于吸附水的脫除；在200～500 ℃之間的質量損失除了APT中配位水和結構水的脫除外，還有FA和CTAB分解的貢獻；隨著CTAB添加量的增加，復合材料在此區間的質量損失率增大，特別是對于FA/APT-5和FA/APT-6，由于吸附CTAB的量大幅增加，在200～300 ℃區間的熱降解最為明顯。熱重分析結果進一步表明，FA被成功負載到APT上，同時CTAB也作用于FA/APT復合材料，實現了FA/APT復合材料的改性。

圖2 APT和FA /APT復合材料的TGA和DTG曲線Fig.2 TGA and DTG curves of APT and FA/APT composites

2.1.3 Zeta電位分析

FA、APT、FA/APT和不同濃度CTAB改性FA/APT復合材料的Zeta電位如圖3所示。由圖可見，FA和APT均帶負電荷，分別為-55.13 mV 和-20.93 mV，當二者結合后Zeta電位仍為負值。當FA/APT被陽離子表面活性劑CTAB改性后，隨著CTAB添加量的增加，Zeta電位逐漸增大。Zeta電位的調節有利于增強復合材料與細菌的界面作用，從而增強FA/APT的抑菌作用。

圖3 FA、APT和FA/APT復合材料的Zeta電位Fig.3 Zeta potentials of FA, APT, andFA/APT composites

2.1.4 比表面積分析

表1列出了實測的APT負載FA前后以及CTAB改性FA/APT后復合材料比表面積和孔結構參數。相比于APT，FA/APT的比表面積(SBET)、外比表面積(Sext)和總孔體積(Vtotal)均明顯減小，尤其是微孔比表面積(Smicro)急劇降低，說明FA分子被成功負載到APT上。經CTAB改性后，FA/APT的SBET、Sext和Vtotal隨CTAB添加量的增加而呈現規律性的減小，表明CTAB分子結合到FA/APT復合材料上。此外，CTAB改性后復合材料的Smicro急劇降低；當CTAB添加量為5%時，微孔表面積消失。該結果表明CTAB分子同時進入到了APT的外部通道和內部孔道[16]。

表1 APT和FA/APT復合材料的比表面積和孔結構參數Table 1 Specific surface areas and pore structural parameters of APT and FA/APT composites

2.2 抑菌性能和機理分析

FA、APT、FA/APT和不同濃度CTAB改性FA/APT復合材料的MIC見表2。可以發現，FA和APT對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均大于5 mg/mL，FA負載到APT后復合材料的抑菌性能沒有明顯提升。采用CTAB改性后，復合材料對金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯增強，并隨著CTAB添加量的增加，MIC值明顯減小。當CTAB用量為5%時，復合材料對金黃色葡萄球菌的MIC可達0.25 mg/mL；當CTAB用量為15%時，MIC可達0.05 mg/mL。但采用CTAB改性后復合材料對大腸桿菌的抑制作用較弱，當CTAB用量達到15%后，對大腸桿菌的抑菌作用才較為明顯(MIC為1 mg/mL)。圖4展示了FA/APT-5(15%)和 FA/APT-6(20%)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度測試平板數碼照片。

表2 FA、APT和FA/APT復合材料的MICTable 2 MIC values of FA, APT, and FA/APT composites

圖4 FA/APT-5和FA/APT-6對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度測試Fig.4 MIC tests of FA/APT-5 and FA/APT-6 against E. coli and S. aureus

通過上述分析可知，FA和APT對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用相對較弱，這與文獻中報道基本一致。蔡防勤等[17]曾采用肉湯和血清肉湯培養基對鞏縣FA的抑菌性能進行了評價，結果證明，鞏縣FA在高濃度時對金黃色球菌、肺炎雙球菌和流感桿菌具有抑制作用，而對大腸桿菌、綠膿桿菌等8種細菌無抑制作用。高金崗等[18]比較了生化FA和常見抑菌藥品的抑菌效果發現，生化FA濃度≥40 mg/mL 時對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蘇云金桿菌及枯草桿菌均有明顯的抑制作用。Enerkom(Pty)公司采用濕法氧化將煙煤轉化為高質量的FA，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度可達15 mg/mL[19]。可以看出，不同來源FA的抑菌性能具有差異性，但均在較高濃度時會產生抑菌效果。相對于體外抑菌性能的評價，國內外關于FA在動物生產中應用的實驗研究報道較多。Qin等[20]評價了FA對藥物致瀉模型小鼠的抗腹瀉作用，發現FA中的含氧官能團尤其是酚羥基和羧基，以及其分子量分布、膠體性質和收斂性，是其發揮抗腹瀉活性的物質基礎。諸多研究[21-24]發現，飼糧中添加FA能夠改善畜禽和水產動物的生長性能和腸道健康狀況，這主要歸因于FA中含有的多種活性功能基團可提高腸道內消化酶活性，進而促進氧化還原和新陳代謝，還可通過抑制病原微生物消除炎癥。

APT在改善動物腸道健康和生產性能方面已有大量報道[25-26]，特別是APT可替代抗生素防控仔豬腹瀉[27]。雖然APT本身的抑菌作用較弱，但其作為載體能夠有效提升抑菌類材料的抑菌性能[28]，歸因于其良好的吸附作用，能夠增強抑菌材料與病原菌之間的界面作用[29]。

季銨鹽是一類具有很強表面活性的陽離子表面活性劑和抑菌劑，其化學結構帶有正電荷和疏水區域，能夠吸附穿透細胞壁，溶解細胞膜，造成細菌內容物的泄漏，進而導致細菌死亡[30]。本研究采用CTAB改性后，復合材料抑菌性能明顯得到了改善。其中，在低濃度CTAB改性下，復合材料對金黃色葡萄球菌具有較強抑制作用，而對大腸桿菌的抑制作用則要CTAB濃度大于10%時才較為明顯，這主要是由兩種細菌的細胞壁結構和成分不同所造成的。大腸桿菌含有脂多糖和脂蛋白組成的外膜，而金黃色葡萄球菌不存在這種外膜。當CTAB吸附到細菌后，必須先溶解外膜，然后與內膜作用，因此金黃色葡萄球菌通常比大腸桿菌更敏感[31]。綜上所述，將具有高生物活性的FA引入到載體APT中，并結合CTAB改性，通過三者的協同作用，復合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現出抑菌活性，具有一定的廣譜抑菌作用。

3 結 論

本文以APT為載體，通過吸附法實現了FA的負載和復合材料的改性。FA和CTAB分子主要通過靜電吸附方式負載于APT，CTAB的引入實現了FA/APT復合材料的電荷調控。CTAB用量越大，FA/APT復合材料的抑菌性能越強，且對金黃色葡萄球菌比大腸桿菌更敏感。當CTAB添加量為15%時，復合材料對大腸桿菌的最小抑菌濃度為1 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度可達0.05 mg/mL。該復合材料的協同效應賦予其一定廣譜抑菌作用，在動物健康養殖方面具有廣闊的應用前景。