外周血microRNA-199a水平與特發(fā)性肺動脈高壓預(yù)后的相關(guān)性

宋瑋 齊詠 陳卓昌

(河南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450000)

特發(fā)性肺動脈高壓(idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH)是肺動脈高壓中的一種特殊類型，是以不明原因的肺小動脈管壁增殖性改變?yōu)橹饕±硖卣鳎M(jìn)而引起肺動脈血管阻力增加、血流受限并最終導(dǎo)致右心功能不全的臨床綜合征[1-2]。一組基于中國人的調(diào)查顯示，IPAH患者經(jīng)常規(guī)治療后5年生存率為20.8%[3]。目前臨床上仍缺乏預(yù)測IPAH疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的特異性強的分子標(biāo)志物。報道顯示，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)參與調(diào)節(jié)IPAH發(fā)展進(jìn)程，可能成為IPAH防治的新的潛在標(biāo)志物[4]。相關(guān)研究[5]表明，miRNA-199a在肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖調(diào)控中具有明確的作用。因此，本研究通過分析外周血miRNA-199a在IPAH患者中的表達(dá)水平，探討其與IPAH預(yù)后的相關(guān)性，旨在為IPAH的預(yù)后預(yù)測尋找可靠的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年11月—2017年11月河南省人民醫(yī)院收治的42例IPAH患者(IPAH組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合IPAH診斷標(biāo)準(zhǔn)，靜息狀態(tài)肺動脈平均壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)，并排除其他病因；(2)年齡≥18歲；(3)本研究取得患者知情同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并腫瘤、嚴(yán)重的肝腎疾病或全身代謝性疾病者；(2)有心肌梗死、肺梗死或腦梗死史者；(3)合并其他系統(tǒng)疾病導(dǎo)致無法配合完成心導(dǎo)管檢查者。42例IPAH患者中，女性27例，男性15例；年齡21～64歲[(36.64±6.20)歲]。另選取同期性別、年齡與IPAH組患者相匹配的健康體檢者40例作為正常對照組。所有患者入院后采集空腹靜脈血5 mL，離心后分離血漿，并于-80 ℃條件下保存。對IPAH患者隨訪觀察2年，隨訪以電話及門診方式進(jìn)行，記錄患者隨訪期內(nèi)生存情況。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器

實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)于羅氏cobas z480全自動熒光定量PCR分析儀進(jìn)行，miRNA提取試劑盒由德國Qiagen生產(chǎn)。

1.2.2 miRNA的提取

冷凍血漿標(biāo)本融化后，將1 mL總提取液加入到300 μL血清樣本中，根據(jù)miRNeasy血漿提取試劑盒操作說明從血漿樣本中提取總RNA。

1.2.3 miRNA逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR檢測

以U6作為實驗內(nèi)參，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA-199a引物，0.15 μL 100 mmol/L dNTPs，1.00 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，1.5 μL 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μL RNase抑制劑，4.16 μL無菌三蒸水；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：1.00 μL TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10.00 μL TaqMan?Universal PCR Master Mix Ⅱ(2×)溶液，1.33 μL cDNA，7.67 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min為一個循環(huán)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min進(jìn)行40個循環(huán)，重復(fù)3次。以2-ΔΔCt法計算miRNA-199a的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料及IPAH組心導(dǎo)管檢查結(jié)果

兩組性別、年齡和身體質(zhì)量指數(shù)比較無顯著差異(P>0.05)。IPAH組心導(dǎo)管檢查結(jié)果詳見表1。

表1 兩組患者一般資料及IPAH組心導(dǎo)管檢查結(jié)果

2.2 外周血miRNA-199a在IPAH組和對照組表達(dá)水平比較

IPAH組外周血miRNA-199a水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.359，P<0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，*表示P<0.05。圖1 外周血miRNA-199a在IPAH組和對照組表達(dá)比較

2.3 IPAH患者外周血miRNA-199a表達(dá)水平與mPAP、肺血管阻力和肺血管阻力指數(shù)的相關(guān)性分析

采用Pearson相關(guān)分析IPAH患者外周血miRNA-199a表達(dá)水平與mPAP、肺血管阻力(total pulmonary vascular resistance，PVR)和肺血管阻力指數(shù)(pulmonary vascular resistance index，PVRi)的相關(guān)性，結(jié)果顯示外周血miRNA-199a表達(dá)水平與mPAP、PVR和PVRi均呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.509，P<0.05；r=-0.637，P<0.05；r=-0.591，P<0.05)。見圖2。

圖2 IPAH患者外周血miRNA-199a表達(dá)水平與mPAP、PVR和PVRi的關(guān)系

2.4 外周血miRNA-199a表達(dá)水平與IPAH患者預(yù)后的關(guān)系

2.4.1 不同預(yù)后IPAH患者外周血miRNA-199a表達(dá)水平比較

截止隨訪時間，42例IPAH患者均獲得完整隨訪，其中12例(28.57%)因心功能不全死亡。據(jù)隨訪結(jié)局，將IPAH患者分為生存組與死亡組，死亡組外周血miRNA-199a表達(dá)水平顯著低于生存組(P<0.05)，見表2。

表2 不同結(jié)局IPAH患者外周血miRNA-199a表達(dá)水平比較

2.4.2 外周血miRNA-199a預(yù)測IPAH患者預(yù)后的ROC曲線分析

繪制外周血miRNA-199a預(yù)測IPAH患者預(yù)后的ROC曲線，取約登指數(shù)最大時對應(yīng)的miRNA-199a水平作為最佳臨界值，結(jié)果顯示外周血miRNA-199a預(yù)測IPAH預(yù)后不良的最佳截斷值為1.36，預(yù)測的AUC為0.834(95%CI0.734～0.908)，與AUC=0.5比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=6.430，P<0.05)。見表3和圖3。

表3 外周血miRNA-199a預(yù)測IPAH患者預(yù)后的預(yù)測效能

圖3 外周血miRNA-199a預(yù)測IPAH患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

近年來報道[6]顯示，循環(huán)血miRNA水平變化與眾多疾病聯(lián)系緊密，有潛力作為疾病早期診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與肺動脈高壓的疾病進(jìn)程密切關(guān)聯(lián)[7-8]。此外，血液中的miRNA不易被降解，相關(guān)報道[9]指出細(xì)胞中的miRNA能以微泡、外來體和凋亡小體等形式分泌入血，從而逃避血漿RNA消化酶對其進(jìn)行消化降解，同時伴隨著微量miRNA提取技術(shù)的快速進(jìn)展，也使得血漿miRNA可能作為判斷IPAH預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

報道指出，在肺動脈高壓和癌癥的致病機制中存在相似的細(xì)胞過度增殖和遷移的相關(guān)病理機制[10-12]。研究[13]顯示，miRNA-199a參與腫瘤疾病進(jìn)程中的細(xì)胞增殖與遷移的調(diào)控，但目前miRNA-199a在IPAH中的作用尚不完全清楚。本組病例中，IPAH組miRNA-199a水平較正常對照組顯著下調(diào)，提示miRNA-199a可能與IPAH病程密切相關(guān)。右心導(dǎo)管檢查是臨床上IPAH診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，本研究中，IPAH患者入院后右心導(dǎo)管檢查均提示患者存在嚴(yán)重的血流動力學(xué)障礙，表現(xiàn)為mPAP、PVR和PVRi等參數(shù)均異常升高。通過相關(guān)性分析，筆者發(fā)現(xiàn)miRNA-199a水平與mPAP、PVR和PVRi呈顯著負(fù)相關(guān)，說明miRNA-199a與IPAH病情嚴(yán)重程度間存在著密切關(guān)聯(lián)。Yang等[14]采用缺氧條件培養(yǎng)大鼠PASMCs，結(jié)果顯示miRNA-199a表達(dá)水平在大鼠PASMCs中顯著下調(diào)了約85%，通過過表達(dá)miRNA-199a可顯著降低缺氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖，從而增加其凋亡；而敲除miRNA-199a可增加PASMCs的增殖和減少其凋亡。結(jié)合Yang等[14]研究，筆者推測IPAH患者外周血miRNA-199a下調(diào)可能反映了IPAH患者PASMCs內(nèi)miRNA的表達(dá)變化，并通過相關(guān)信號通路調(diào)控PASMCs增殖和凋亡的形式參與IPAH疾病進(jìn)程，但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制有待后續(xù)研究進(jìn)一步明確。IPAH好發(fā)于女性患者，并且預(yù)后較差，患者多因進(jìn)行性的右心功能不全而致右心衰竭死亡。本研究中IPAH患者發(fā)病特征與以往報道[15]的IPAH人口學(xué)特征相符，另外通過分析外周血miRNA-199a表達(dá)水平與IPAH患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，低外周血miRNA-199a表達(dá)水平提示IPAH預(yù)后差。ROC曲線分析顯示，外周血miRNA-199a預(yù)測IPAH預(yù)后不良的最佳截斷值為1.36，預(yù)測的AUC為0.834(95%CI0.734～0.908)，提示其對IPAH患者預(yù)后具有較好的預(yù)測價值。

綜上所述，本研究結(jié)果表明外周血miRNA-199a表達(dá)水平在IPAH患者明顯下調(diào)，其能較好地預(yù)測IPAH患者預(yù)后，可能是IPAH預(yù)后預(yù)測的潛在分子標(biāo)志物。