基于PI3K、Akt信號通路探討山臘梅葉乙醇提取物的降糖降脂作用

潘建萍，凌志杰，李明

贛南衛生健康職業學院，江西 贛州 341000

2型糖尿病作為臨床目前多發、常見的慢性代謝疾病，發病機制與遺傳因素、年齡因素、生活方式及飲食習慣等多種因素密切相關，其主要發病特點是糖代謝異常[1-4]。同時，由糖尿病引發的血脂異常，也是引發心腦血管等重要臟器疾病的重要因素[5-6]。其中胰島素受體底物-1（IRS-1）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）信號通路是胰島素調節血糖平衡的關鍵途徑，它在機體葡萄糖利用轉化等生理功能中發揮關鍵作用，具有改善機體血糖、血脂代謝等作用[7-8]。《本草綱目》中記載：山臘梅有清熱解毒、健胃消食之效，同時Chen Hui等[9]研究中發現山臘梅葉總乙醇提取物具有降血脂、降血糖和抗氧化等作用，這也預示著其可能具有降糖作用，但具體作用機制有待于進一步研究。該文基于IRS-1、PI3K、AKT傳導通路研究，探討山臘梅葉乙醇提取物對高脂高糖糖尿病大鼠血糖血脂的作用及機制，以期能夠為臨床有效用藥提供依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

取Wistar雄性大鼠75只，年齡7周齡左右，體質量平均（240±20）g，大鼠的大小、年齡、體重等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。按照國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養，自由攝食、飲水。大鼠飼養環境保持安靜，室溫調節在22～30℃、濕度調控在40%～70%。

1.2 山臘梅葉提取

實驗藥物取江西佑美山臘梅基地山臘梅葉進行乙醇提取。將干燥山臘梅葉粉碎后，經多功能提取罐熱回流提取，用10倍體積80%乙醇在60℃溫度條件下反復提取2次，3 h/次。提取液經減壓回收溶劑后真空干燥，得到乙醇提取物浸膏。

1.3 構建高脂高糖大鼠模型

利用高脂高糖飼料喂養+腹腔注射小劑量STZ以此構建高血糖、高脂血癥的2型糖尿病大鼠[10-11]。先用高脂高糖飼料喂養4周，使動物處于糖尿病前期的輕微的胰島素抵抗狀態，后4周根據大鼠體質量，高脂高糖飼料喂養組腹腔注射40 mg/kg檸檬酸緩沖液溶解（STZ），并持續喂養高脂高糖飼料。注射3 d后，自尾靜脈采血，連續3 d血糖濃度均>11.1 mmol/L視為造模成功。

1.4 分組與給藥

大鼠隨機分為5組：正常對照組、模型組、山臘梅葉提取物低劑量、高劑量組及二甲雙胍組，每15只，各組大鼠體質量、年齡差異無統計學意義。低、高劑量藥物組大鼠分別灌胃給予乙醇提取物250 mg/kg和500 mg/kg，二甲雙胍組灌胃給予大鼠二甲雙胍100 mg/kg，正常組及模型組給予等體積生理鹽水。正常組以正常飼料喂養，其他組以高脂高糖飼料喂養+腹腔注射小劑量STZ處理。

1.5 觀察指標

1.5.1 全自動生化分析儀檢測血清 膽固醇（TC），三酰甘油（TG）及低密脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量 給藥8周結束時，大鼠禁食不禁水12 h，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動物，從下腔靜脈缺血，注入離心管（4℃），以3 000 r/min離心20 min后提取血清，用全自動生化分析儀測定血清TC、TG、LDL-C水平。

1.5.2 酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測血清胰島素水平檢測前先對樣品進行低溫離心，取血漿，根據試劑盒說明書進行檢測。在反應孔中加人100 μL標準品或待測標本，在空白孔中加入等量稀釋液，用37℃培養箱進行孵育，孵育后洗滌，最后加酶標抗體進行酶聯免疫反應，反應終止后在酶標儀上進行檢測。檢測波長為450 nm，空白孔調零，測定各孔吸光度值。

1.5.3 檢測肝臟相關蛋白表達 大鼠取血后處死，小心取出完整肝臟，進行液氮預凍處理，并放到-80℃的冰箱中冷凍保存、待取用。使用蛋白免疫印跡法測定胰島素抵抗最主要的通路PI3K、AKT信號傳導通路中胰島素受體底物（IRS）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、葡萄糖轉運體4（GLUT-4）4種相關蛋白質的表達。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 山臘梅葉乙醇提取對大鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01），提示造模成功；與模型組比較，山臘梅葉乙醇提取物低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平均明顯降低，胰島素水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血糖、糖化血紅蛋白和胰島素的測定結果對比

表1 各組大鼠血糖、糖化血紅蛋白和胰島素的測定結果對比

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別 空腹血糖（mmol/L） 糖化血紅蛋白（%） INS（mU/L）正常對照組（n=15）模型組（n=15）二甲雙胍組（n=15）低劑量組（n=15）高劑量組（n=15）5.64±0.72（14.76±1.94）a（6.86±0.85）c（8.04±1.06）c（6.48±0.93）c 5.91±1.12（17.56±3.59）a（7.57±1.52）c（10.02±2.96）b（8.43±2.56）c 91.36±19.79（21.25±5.02）a（52.58±11.35）c（38.42±7.82）c（49.38±9.16）c

2.2 山臘梅葉乙醇提取對大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的影響

與正常組比較，模型組糖尿病大鼠血清TC、TG及LDL-C水平均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，山臘梅葉乙醇提取物低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠血清TC、TG及LDL-C水平均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的測定結果對比[（），mmol/L]

表2 各組大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的測定結果對比[（），mmol/L]

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別 TC TG LDL-C正常對照組（n=15）模型組（n=15）二甲雙胍組（n=15）低劑量組（n=15）高劑量組（n=15）8.14±1.91（16.18±2.97）a（9.26±1.84）c（12.07±3.31）b（10.68±2.18）c 5.42±0.85（9.82±1.65）a（7.57±1.52）b（8.28±2.06）b（7.39±1.68）c 1.93±0.34（10.41±1.95）a（5.56±1.22）c（7.95±1.58）c（4.69±0.83）c

2.3 實驗大鼠肝臟IRS、PI3K、AKT、GLUT-4測定結果

與正常對照組相比，其他組IRS、PI3K、AKT、GLUT-4表達皆降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，山臘梅葉乙醇提取物低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4表達均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 實驗大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4測定結果對比

表3 實驗大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4測定結果對比

注：與模型組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 IRS PI3K AKT GLUT-4正常對照組（n=15）模型組（n=15）二甲雙胍組（n=15）低劑量組（n=15）高劑量組（n=15）（1.03±0.24）a 0.32±0.11（0.46±0.14）ab（0.55±0.16）a（0.62±0.21）ab（1.01±0.21）a 0.26±0.08（0.47±0.15）a（0.58±0.1）7ab（0.43±0.12）ab（1.01±0.21）a 0.36±0.13（0.79±0.34）a（0.61±0.21）ab（0.56±0.16）ab（1.00±0.20）a 0.25±0.06（0.68±0.24）ab（0.48±0.16）a（0.62±0.21）ab

3 討論

目前，人們生活水平有了很大的提高，糖尿病臨床發病率也呈逐年增長的趨勢，且發病年齡更見向著年輕化發展，成為繼腫瘤、心腦血管疾病后的第三大威脅人類健康的慢性疾病。胰島素對體內血糖穩態的調節發揮著重要的作用。胰島素與靶器官細胞膜表面的胰島素受體結合，并通過細胞信號傳導通路調節糖代謝相關基因的表達從而發揮調節代謝功能[12-14]。IRS-1、PI3K、Akt信號通路是胰島素信號轉導的主要途徑。研究表明IRS-1在體內以磷酸化的形式被激活后與下游受體蛋白相互作用，并能夠使其下游的PI3K活化，PI3K被激活后進一步活化Akt，Akt活化后能夠進一步激活下游蛋白，從而促進細胞內能量代謝，增加體內葡萄糖消耗，從而抑制體內脂質的合成[15]。相反，該通路中任何一個因子或環節出現功能障礙或表達異常均可誘發胰島素抵抗，出現糖尿病和高脂血癥等多種疾病[16-18]。該次研究結果顯示，山臘梅葉乙醇提取物能夠上調IR3、PI3K、AKT水平，加速GLUT-4轉運，促進其向細胞膜的移位與骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取，繼而達到降低血糖、維持糖代謝平衡的作用。

山臘梅即亮葉臘梅，在江西廣泛分布，是畬族最常用的治療糖尿病的藥材。贛南山區稱食涼茶，又稱黃金茶。近年來，人們也逐漸加大了對山臘梅的開發力度，山蠟梅單品或以其為主要原料的方劑已加工成山蠟梅葉顆粒，山蠟梅清感茶、山蠟梅滴丸、脾胃舒等成品藥。該研究結果顯示，與模型組大鼠比較，山臘梅葉乙醇提取物低、高劑量組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清TC，TG及LDL-C水平均改善，2 h餐后血清胰島素和肝臟IRS-1、PI3K、Akt、GLUT4蛋白表達水平均明顯升高，表明山臘梅葉乙醇提取物調節血糖平衡，促進胰島素分泌的機制可能是通過上調胰島素受體信號轉導通路IRS-1、PI3K、Akt途徑磷酸化水平蛋白表達，提高GLUT4蛋白的表達和跨膜轉運，從而促進大鼠對葡萄糖的轉運和利用，減少脂質的生成。