6株芽孢桿菌的分離鑒定和生物學特性

田照輝 徐紹剛 董穎 胡紅霞 王巍 東天 孫愛

摘要：為了篩選適合漁用微生態(tài)制劑的益生菌，從池塘邊發(fā)酵魚肉湯中分離芽孢桿菌，結(jié)合形態(tài)學、生理生化特征、16S rRNA及gyrA、gyrB、rpoB和purH基因序列比對分析對其進行鑒定，并對其產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)蛋白酶能力及生長情況進行研究。結(jié)果表明，分離篩選的6株芽孢桿菌分屬于4個種，1株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），1株為阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai），2株為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），2株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），6株菌在LB液體培養(yǎng)基中生長良好，均具有產(chǎn)蛋白酶能力，其中4株具有產(chǎn)淀粉酶能力。

關鍵詞：芽孢桿菌;分離鑒定;生物學特性;產(chǎn)淀粉酶能力;產(chǎn)蛋白酶能力

中圖分類號： S917.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0157-05

一直以來，抗生素和藥物殘留是食品安全的重要威脅，2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織制定了《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案》，推行減抗行動。微生態(tài)制劑能夠提高動物的免疫力和生產(chǎn)性能，為綠色飼料添加劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，微生態(tài)制劑還能有效調(diào)控水質(zhì)，是實現(xiàn)高效綠色養(yǎng)殖模式的有效措施之一[1]。

芽孢桿菌是一類重要的微生態(tài)制劑，可以形成芽孢，耐高溫，具有較強的生存能力。在缺乏營養(yǎng)或不良環(huán)境時，芽孢桿菌可以生成芽孢來增強抗逆性進入消化道，調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制病原菌生長。芽孢桿菌還能促進機體免疫器官及組織的成熟，可以促進淋巴細胞數(shù)量增加，從而提高機體的體液免疫、細胞免疫水平，芽孢桿菌在動物、人體的微生態(tài)調(diào)節(jié)中得到了高度重視和廣泛應用，是較好的微生態(tài)制劑菌種[2]。劉文亮等在飼料中添加蠟樣芽孢桿菌投喂凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），發(fā)現(xiàn)可以改變凡納濱對蝦的腸道微生物組成，提高其生長速度，增強其抗病能力[3]，將蠟樣芽胞桿菌添加到凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中，可以提高凡納濱對蝦抗白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）和感染能力[4]。孫盛明等在飼料中添加枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)能夠提高團頭魴幼魚的生長性能、抗氧化能力并改變其腸道菌群結(jié)構(gòu)[5]。張歡歡等在生物絮團對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加其分離到的芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)能夠改善菌群結(jié)構(gòu)，抑制弧菌生長[6]。芽孢桿菌、乳酸菌益生菌在卡他扇貝（Argopecten ventricosus）早期發(fā)育過程中能夠促進卡他扇貝生長、抵抗溶藻弧菌病[7]。在飼料中添加枯草芽孢桿菌后，草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道和肝胰臟消化酶的活性顯著提高，腸道芽孢桿菌、假單胞菌數(shù)量極顯著提高，致病性弧菌、大腸稈菌數(shù)量極顯著減少[8]。芽孢桿菌能產(chǎn)生胞外酶，如高蛋白酶、高淀粉酶活性，可以高效降解養(yǎng)殖殘餌中的蛋白和淀粉，改善修復養(yǎng)殖環(huán)境。將芽孢桿菌類應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，進行水質(zhì)調(diào)控，還可作為有害菌的拮抗菌替代或減少抗生素的使用。枯草芽孢桿菌 HAINUP40可顯著降低水體中的亞硝酸鹽、氨氮和化學需氧量，不僅可以作為水質(zhì)改良劑改善水體環(huán)境，還可作為飼料添加劑提高羅非魚的疾病抵抗力，預防無乳鏈球菌疾病的發(fā)生[9]。短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）能夠抑制多種水產(chǎn)病原菌，對水體環(huán)境的耐受能力強，具有防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的應用潛力[10]。高艷俠等篩選的貝萊斯芽孢桿菌具有較強的廣譜拮抗水產(chǎn)常見病原菌功能，能有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類常見病原菌如無乳鏈球菌、 海豚鏈球菌等[11]。張皎皎等篩選的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）對嗜水氣單胞菌的抑制效果顯著[12]。

有益微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能有效改善水質(zhì)，其應用越來越廣泛，但仍存在一些問題，如有些菌種的效果不高，穩(wěn)定性差，不能快速成為優(yōu)勢菌群等[13]，微生態(tài)制劑菌種還具有種屬特異性和地域性，一般從微生物生活的環(huán)境中分離和篩選特定功能益生菌，因此從相應的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境分離菌株，用于篩選水產(chǎn)微生態(tài)制劑菌種更具有合理性[14-16]。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2018年夏將池塘中零星死亡的魚收集起來，在塘邊煮成肉糜，任其自然發(fā)酵，待發(fā)酵肉湯無色無臭后，取回至北京市水產(chǎn)科學研究所實驗室進行菌種分離。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L氯化鈉、2%瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌 15 min ，倒平板上備用[17]。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基 12 g/L脫脂奶粉、20 g/L營養(yǎng)瓊脂，113 ℃高壓滅菌15 min，倒平板上備用。

1.2.3 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選培養(yǎng)基 可溶性淀粉 5 g/L、氯化鈉5 g/L、pH值7.2，將除瓊脂外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH值，加入2%瓊脂粉，于115 ℃高壓滅菌15 min，倒平板備用。

1.3 菌種分離

在無菌條件下，于滅菌后的三角瓶中加入 90 mL 無菌水和10 mL發(fā)酵肉湯，混勻后取10 mL懸浮液置于無菌試管中，在80 ℃保溫15 min殺死非芽孢菌體，之后取1 mL進行梯度稀釋制成懸液，濃度依次為發(fā)酵肉湯原液的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分別取50 μL各稀釋液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑選單菌落，傳代3次以上，待菌落穩(wěn)定后，挑取單菌落用營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)24 h，進行革蘭氏染色、芽孢染色，在顯微鏡下觀察，選取有芽孢的G+菌，滅菌甘油保存于-80 ℃。

1.4 生理生化鑒定

利用HIBacillusTM Identification Kit和參照微生物試驗中的糖酵解試驗進行鑒定。

1.5 分離純化芽孢菌株產(chǎn)蛋白酶活力和產(chǎn)淀粉酶活力測定

挑選單菌落點種于“1.2.2”節(jié)所述培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)17 h，取出后4 ℃放置6 h，以芽孢桿菌利用底物產(chǎn)生透明圈直徑和菌體直徑的比值表示產(chǎn)酶活性。

挑選單菌落點種于“1.2.3”節(jié)所述培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)17 h，取出后4 ℃放置6 h，滴加魯哥氏碘液顯色，以芽孢桿菌利用底物產(chǎn)生透明圈直徑和菌體直徑的比值表示產(chǎn)酶活性。

1.6 分子生物學鑒定

挑選純化的菌株參照曹鳳明等的方法[17-18]設計引物，將純化的菌株送北京擎科生物技術有限責任公司進行16S rRNA、gyrA、gyrB、rpoB、purH基因測序，測序引物序列見表1。

1.7 生長曲線的測定

將保存的芽孢桿菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上復蘇，挑單克隆在LB培養(yǎng)基中于37 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的芽孢桿菌按1%的量接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h使用伯樂（Bio-Rad）公司的SmartSpec Plus分光光度計檢測菌液D600 nm，以測定D600 nm為縱坐標、以時間為橫坐標繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

經(jīng)過初篩、復篩，選取6株分離得到的菌株，將其編號為2019B1～2019B6，各菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色和芽孢產(chǎn)生情況見表2。

2.2 生理生化反應的鑒定

利用芽孢桿菌鑒定試劑盒HIBacillusTM Identification Kit的檢測結(jié)果見表3，糖酵解試驗結(jié)果見表4。

2.3 產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶活性

用透明圈直徑/菌落直徑的值表示產(chǎn)酶能力[19]。由表5可以看出，6株菌株均具有產(chǎn)蛋白酶能力，其中2019B1和2019B6產(chǎn)蛋白酶能力最強;2019B2、2019B6無產(chǎn)淀粉酶能力，其他4株具有產(chǎn)淀粉酶能力，其中2019B5產(chǎn)淀粉酶能力最強。

2.4 分子生物學鑒定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹

將各菌株的16S rRNA核苷酸序列在GenBank中進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)每株都有多個與其同源性達99%以上的種，選取GenBank中與6株菌株同源性高的菌株的模式菌株的16S rRNA序列，用MEGA 6軟件進行同源性比對并構(gòu)建鄰接（NJ）樹，自展次數(shù)為1 000次（圖1）。由系統(tǒng)發(fā)育樹可見，2019B1與蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）聚為一支，2019B2與阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai）聚為一支，2019B3、2019B4與貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）聚為一支，2019B5、2019B6與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）聚為一支。

除利用16S rRNA序列進行測序比對外，還對各菌株進行gyrA、gyrB、rpoB和purH基因的測序，并在GenBank中進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)2019B1的purH基因序列比對結(jié)果為蠟樣芽孢桿菌，2019B3、2019B4的gyrA、purH基因序列的比對結(jié)果分別為貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，rpoB基因序列的比對結(jié)果均為貝萊斯芽孢桿菌，2019B5的gyrA基因序列比對結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌，2019B6的rpoB、purH基因序列比對結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌。

2.5 菌株鑒定結(jié)果

結(jié)合形態(tài)學、生理生化和分子生物學檢測結(jié)果可知，2019B1為蠟樣芽孢桿菌（B. cereus），2019B2為阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai），2019B3、2019B4為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），2019B5和2019B6為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

2.6 生長曲線

由圖2可以看出，6株芽孢桿菌均能在37 ℃的LB液體培養(yǎng)基中正常生長，達到較高濃度。其中，2019B2長勢最好，培養(yǎng)13 h時已接近穩(wěn)定期;2019B1、2019B2在培養(yǎng)2 h時就開始進入快速增長期， 在培養(yǎng)6.3 h后濃度增長放緩， 2019B1尤其明顯;2019B4在培養(yǎng)4 h才開始生長，并逐漸結(jié)束遲緩期，在培養(yǎng)6.3 h進入快速生長期;2019B6的生長情況比較平穩(wěn)，2019B3、2019B5的生長曲線比較一致，在培養(yǎng)4 h內(nèi)和2019B6的長勢相似，培養(yǎng)2 h內(nèi)為遲緩期，培養(yǎng)2～4 h時生長開始增快，培養(yǎng)4 h后2019B3、2019B5快速增長，遠遠超過2019B6。

3 討論與結(jié)論

枯草芽孢桿菌于1835年被正式命名，隨著研究技術的進步，人們發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌是一個表型相似近緣種群（簡稱枯草群），其形態(tài)特征和生理生化特征是早期進行各種群分類與鑒定的基礎，16S rRNA基因含有豐富的信息量，已經(jīng)成為細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的標準，但是將分離篩選的菌株進行16S rRNA基因序列同源性檢索時發(fā)現(xiàn)，多數(shù)菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中幾種芽孢桿菌的同源性達99%以上，這是因為枯草芽孢桿菌是一個表型相似近緣種群（簡稱枯草群），枯草群多個種類的16S rRNA基因序列相似性均在99.5%以上，目前NCBI（美國國家生物技術信息中心）核酸數(shù)據(jù)庫中，16S rRNA、gyrB、gyrA、rpoB、 purH等基因已涵蓋了枯草群的各個種，可利用這些基因進行相關菌株的鑒定和鑒別[18]，因此本研究在分離篩選芽孢桿菌時，不僅進行了生理生化鑒定，還進行了分子生物學鑒定，在進行分子生物學鑒定時除進行16S rRNA測序建樹，各菌株還進行了gyrA、gyrB、rpoB和purH基因的測序同源比對，將傳統(tǒng)方法與分子生物學方法相結(jié)合，互為補充和驗證。

在生產(chǎn)過程中微生態(tài)制劑對于篩選益生菌尤其關鍵，種屬特異性是篩選合適益生菌的一個先決條件，不同來源的芽孢桿菌在不同動物胃腸道內(nèi)的黏附繁殖能力及相關生理功能有所不同[16]。水產(chǎn)養(yǎng)殖戶在池邊將零星死亡的魚煮成肉糜自然發(fā)酵，待其無臭無味后潑灑使用，能有效地改善水質(zhì)，池塘養(yǎng)殖魚未出現(xiàn)不良反應，說明發(fā)酵后的魚肉湯是安全的，可能含有能有效凈化水質(zhì)的微生物，從這種發(fā)酵的魚肉湯中分離的菌株，可能來源于魚體或周邊環(huán)境，更適合在本區(qū)域池塘養(yǎng)殖使用。

本研究分離鑒定得到了6株芽孢桿菌，分屬于4種，即1株蠟樣芽孢桿菌，1株阿氏芽孢桿菌，2株解淀粉芽孢桿菌，2株貝萊斯芽孢桿菌，均具有產(chǎn)蛋白酶能力，其中4株具有產(chǎn)淀粉酶能力，6株菌在LB液體培養(yǎng)基中生長良好，為之后進一步研究其環(huán)境耐受性、體外抑菌試驗、水質(zhì)凈化作用及對魚類的免疫作用研究奠定了基礎。

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