豌豆細菌性疫病菌的分類與檢測技術研究進展

許萍萍 劉曉宇 許忠祥 楊靜 周密密 錢茱希 李彬 吳翠萍 安榆林

摘要：由丁香假單胞菌豌豆致病變種引起的豌豆細菌性疫病可引起寄主植物花梗、花和豆莢等萎蔫枯死，導致植株猝倒，對產量影響較大。目前在世界各豌豆重要生產區廣泛發生并嚴重危害，至今尚無有效防治措施。為防范該病菌隨著豌豆進口傳入我國，需要提高對該病菌的認識，研制更加快速、高效的檢測方法。丁香假單胞菌豌豆致病變種與適合致病變種等9個致病變種組成基因型Ⅰ。根據丁香假單胞菌豌豆致病變種與不同豌豆品種致病性的不同，該變種又可分為8個生理小種。利用該病菌特異性片段設計的引物進行PCR擴增產物的不同，可將上述8個生理小種分為2個系統發育群。目前，對該病菌的鑒定主要通過常規的生理生化方法和環介導等溫及多位點序列分析等分子生物學方法。上述檢測方法存在檢測周期長、檢測效率低，且不能快速區分陽性結果是否來源于病原菌活細胞或死細胞等問題。可通過探索建立實時熒光PCR和數字PCR檢測方法，來實現快速準確鑒定目標菌種，并對供試菌株的活性進行鑒定的目標。

關鍵詞：豌豆;豌豆細菌性疫病病菌;病害;丁香假單胞菌豌豆致病變種;分類;檢測

中圖分類號：S436.43 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0046-05

豌豆細菌性疫病為我國禁止進境植物檢疫性細菌病害，由丁香假單胞菌豌豆致病變種（Pseudomonas syringae pv. pisi）侵染引起，1915年首次報道在美國科羅拉多州發生[1]，至今已有百余年。隨后該病害迅速擴散至世界各豌豆重要生產區，我國尚無分布。該病菌可引起寄主植物花梗、花和豆莢等萎蔫枯死，導致植株猝倒，早期侵染即可造成嚴重損失，對豌豆產量影響較大[2]。

豌豆細菌性疫病菌主要隨種子進行遠距離傳播[3]，病菌在種子表面或種子內部可存活數個生長季節，經表面藥劑處理后的種子內部仍有病菌存活[4]，因此極難防治。豌豆是我國第一大食用豆進口品種，我國是全球第二大進口國，加拿大、美國是我國的豌豆主要進口國[5]。根據歐洲和地中海植物保護組織（EPPO）2020年數據，豌豆細菌性疫病在加拿大廣泛分布，美國的加利福利亞州、科羅拉多州、堪薩斯州、紐約州、華盛頓州、威斯康辛州均有分布。2013年，原廈門檢驗檢疫局從加拿大進口豌豆中檢測出豌豆細菌性疫病病菌，其后也有其他口岸截獲該致病菌。因此，為有效降低豌豆細菌性疫病病菌傳入風險，需要進一步提高對該病菌的認識，有效加強進口豌豆種子的檢疫。

1 豌豆細菌性疫病病菌的屬性及分類

1.1 基本屬性

豌豆細菌性疫病的病原菌為丁香假單胞菌豌豆致病變種，屬于薄壁菌門（Gracilicutes）假單胞菌科（Pseudomonadaceae）假單胞菌屬（Pseudomonas）丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的致病變種，屬于革蘭氏陰性菌。該病菌主要寄主為豌豆（Pisum sativum），自然條件下也可侵染扁豆（Lablab purpureus）、山黧豆（Lathyrus odoratus）、寬葉山黧豆（L. latifolius）、野豌豆屬（Vicia spp.）植物和孟加拉野豌豆（V. benghalensis）[6]。

1.2 現有分類

1.2.1 基因型 丁香假單胞菌寄主范圍廣，常見的致病變種已達60多種[7-8]，種內致病變種的區分和鑒定一直是植物病原細菌鑒定中的難點。Gardan 等1999年根據 DNA-DNA 雜交和核糖體分型將 48個致病變種及相關假單胞桿菌劃分為 9 類基因型，其中丁香假單胞菌豌豆致病變種與適合致病變種（P. syringae pv. aptata）、猝倒致病變種（P. syringae pv. lapsa）、皰疹致病變種（P. syringae pv. papulans）、致黑致病變種（P. syringae pv. atrofaciens）、大葉槭致病變（P. syringae pv. aceris）、黍致病變種（P. syringae pv. panici）、臭楝致病變種（P. syringae pv. dysoxyli）、日本致病變種（P. syringae pv. japonica）等 9個致病變種組成基因型1[9]。同基因型內的不同致病變種遺傳關系非常接近，難以區分。

1.2.2 生理小種 Taylor等1995年通過研究該病原菌與8個不同豌豆栽培種無毒基因（A）與抗性基因（R）的相互作用將其分為7個生理小種[10]，詳見表1。Martin-Sanz等2011年報道新的8號生理小種，有熒光，可擴增出272 bp條帶[11]。

1.2.3 血清學分類 Grondeau等1992年使用血清學方法將供試的所有丁香假單胞菌豌豆致病變種分成3個O血清型，分別為APT-PIS、HEL2和RIB[12]。

1.2.4 2個系統發育群 Arnold等1996年找出病原菌特異性片段，并以此設計引物進行PCR擴增，所有的7個生理小種分別擴增出272 bp或132 bp片段，因此將7個生理小種分為2個系統發育群，Ⅰ群為1、5、7生理小種，Ⅱ群為2、3、4、6生理小種[13]。在這個研究中，作者還首次發現應屬于Ⅱ群的3、4號生理小種的少量菌株擴增出屬于Ⅰ群的條帶，因此又將3、4號生理小種分為3A/B，4A/B。這個分類在Cournoyer等1996年基于HrpL基因對該病菌的DNA序列分析中得到驗證[14]。丁香假單胞菌豌豆致病變種分類情況詳見表2。

2 豌豆細菌性疫病病菌的檢測

2.1 檢測中容易混淆的近似菌

我國每年進口的豌豆95%以上來自加拿大[15] 。由于豆類對后茬作物增產效果非常顯著，在加拿大，豌豆、扁豆、鷹嘴豆廣泛作為小麥、油菜的前茬作物[16]。因此，進口的豌豆中極易混雜有扁豆、鷹嘴豆、小麥、油菜等的種子，在丁香假單胞菌豌豆致病變種的檢測中，上述夾雜的種子容易攜帶的丁香假單胞菌的其他致病變種細菌需要進行排除。Lelliott等發現，熒光假單胞菌（P. fluorescens）、惡臭假單胞菌（P. putida）廣泛存在于土壤中，綠黃假單胞菌（P. viridiflava）和丁香假單胞菌丁香致病變種（P. syringae pv. syringae）正常存在于植物地上部分[17]。這些細菌容易污染豌豆種子。Grondeau等發現血清學方法不能將丁香假單胞菌豌豆致病變種與丁香致病變種、綠黃假單胞菌進行區分[12]。 進口豌豆檢測中容易與豌豆細菌性疫病病菌混淆的細菌詳見表3。在檢測進口豌豆細菌性疫病病菌時，可以通過查詢表3的寄主信息和發生國家/地區信息，判斷可能存在的其他假單胞菌種類。如對加拿大進口豌豆檢測中，丁香假單胞菌大豆致病變種、斑生致病變種、菜豆致病變種、丁香致病變種、熒光假單胞菌、綠黃假單胞菌就是重點排除對象。

2.2 現有檢測方法

2.2.1 常規生理生化方法

2.2.1.1 細菌分離 種子表面用 0.5%次氯酸鈉消毒5 min，滅菌水洗3次，將消過毒的種子放在KB瓊脂培養基上培養。25 ℃培養2～3 d，出現光亮黏稠隆起的菌落[18]。

2.2.1.2 生化測試

2.2.1.2.1 革蘭氏判定 簡單快速地進行預鑒定，可以采用KOH法，用接種環蘸取細菌和2滴3% KOH混合，若細菌變黏，則為革蘭氏陰性菌，不變黏，則為革蘭氏陽性菌[7]。

2.2.1.2.2 熒光色素沉著 將在含有1%酪氨酸的KB培養基上劃線培養了24～48 h的細菌菌落，放紫外燈下觀察熒光色素沉著。

2.2.1.2.3 過氧化氫酶 新鮮的細菌培養物放在潔凈的載玻上，加1滴10%過氧化氫。該病原菌應出現有氣泡產生的陽性反應。

2.2.1.2.4 硝酸鹽測試 選擇含硝酸鹽源的培養基接種細菌分離株。培養基顏色的變化意味著細菌是厭氧，在無氧呼吸時將硝酸鹽（NO-3）還原為亞硝酸鹽（NO-2）。該病原菌不能降解N，因此不能產生陽性反應。

2.2.1.2.5 LOPAT試驗 即果聚糖試驗、氧化酶試驗、馬鈴薯軟腐試驗、精氨酸雙水解酶試驗和煙草過敏試驗。該病原菌LOPAT測試結果為果聚糖試驗和煙草過敏試驗陽性，氧化酶試驗、馬鈴薯軟腐試驗、精氨酸雙水解酶試驗均為陰性。

2.2.2 血清學方法 Grondeau等1992年使用血清學方法對豌豆疫病病菌進行鑒定[3]。將供試的所有丁香假單胞菌豌豆致病變種分成3個O血清型，分別為APT-PIS（占比88.5%）、HEL2（11.4%）、RIB（0.1%）。同時指出血清學方法不能區分豌豆細菌性疫病病菌和丁香假單胞菌丁香致病變種和綠黃假單胞菌[12]。

2.2.3 分子生物學方法

2.2.3.1 環介導等溫擴增（LAMP）檢測法 封立平等2013年根據丁香假單胞菌豌豆致病變種的肽相關脂蛋白（oprL）特異性基因設計了2對引物FIP/BIP和F3/B，建立了丁香假單胞菌豌豆致病變種環介等溫擴增檢測體系，其結果表明2對引物特異性強，可特異性區分丁香假單胞菌丁香致病變種、綠黃假單胞菌、丁香假單胞菌大豆致病變種、丁香假單胞菌菜豆致病變種。其檢測靈敏度比普通PCR高出100倍[19]。

2.2.3.2 多位點序列分析 陳青等2016年使用E11/E16、E22/E26等7對引物，對菌株的16S、gap1、gltA等6個序列進行 PCR 擴增和測序，并結合進行Biolog 測定、煙草過敏性反應和致病性測試，最終將菌株鑒定為豌豆細菌性疫病病菌[6]。

2.2.3.3 常規PCR技術 基于常規PCR技術對細菌的檢測常以擴增病原菌基因組的核糖體基因序列16S rDNA 、16S-23S rDNA間隔區或看家基因gap1、gltA、gyrB 和 rpoD為基礎，由于丁香假單胞菌的核糖體、看家基因的高度保守性，因而單純以 16S rDNA 或看家基因為目標片段序列，設計的引物探針，很難有效鑒別丁香假單胞菌致病變種。

對于不同寄主植物有著不同的致病性是丁香假單胞菌的重要鑒別特征，致病基因以及致病相關基因很可能作為丁香假單胞菌不同菌株以及致病變種的分類鑒定指標。丁香假單胞菌通過獲得hrp基因簇從而發展成植物病原菌[20]。植物病原細菌的hrp基因參與對寄主植物的致病性反應以及激發對非寄主植物的過敏性反應。Inoue等分別于2000年和1999年發現hrpS、hrpA、hrpZ以及hrpB基因在不同丁香假單胞菌菌株之間的排列順序始終一致，有著高度同源，對于丁香假單胞菌分組鑒定有著重要的意義[21-22]。控制丁香假單胞菌變種產生乙烯的是位于丁香假單胞菌的一個原源質粒上的efe基因，Weingart 等1999年基于efe基因設計了引物 EFEP1/EFEP2用于檢測丁香假單胞菌豌豆致病變種[23]。

2.2.3.4 紅外光譜檢測 徐曉鷗等2014年使用紅外光譜技術，利用菜豆暈疫病病菌和豌豆細菌性疫病病菌在3 000～4 000 cm-1內，分別具有特異性峰位，來鑒定2種菌。該方法檢測周期僅為2 h左右，檢測步驟簡潔，樣品前處理便捷[24]。

總之，在該病原菌的檢測上，生理生化方法耗費時間較長，同時一些理化鑒定結果易于因為主觀上的差異從而不能客觀反映不同致病變種之間的差異。近些年，在分子生物學檢測方法上，進行了較多的嘗試，但存在特異性不足、缺乏對病原菌的活性判定等問題。

3 問題與展望

丁香假單胞菌寄主范圍廣，且有眾多的致病變種，致病變種的區分和鑒定一直是植物病原細菌鑒定中的難點。現有的丁香假單胞菌豌豆致病變種的檢測方法存在檢測周期長、檢測效率低且不能快速區分陽性結果來源與病原菌活細胞或死細胞等缺點，從而影響口岸通關效率。

使用實時熒光PCR，根據不同致病變種丁香假單胞菌基因組中特定基因序列的差異性，設計特異性引物，可快速、精準鑒別目標致病變種，并具有較高的靈敏度。包奇等2016年建立的基于實時熒光定量PCR技術檢測桑丁香假單胞菌的方法，從供試的29株菌株中特異性檢測出桑丁香假單胞菌，檢測極限可達普通PCR的1/1 000[25]。

相對于實時熒光PCR技術，數字PCR技術具有特異性更高、靈敏度更好、無需外部標準的絕對定量等優點，其檢測結果一般不受擴增效率的影響，對PCR抑制物的耐受性也比較高，因此重復性也更好[26]。田茜等2018年建立了水稻細菌性條斑病病菌和白葉枯病病菌數字PCR檢測方法，均可特異性檢測到目標病菌的供試菌株;同時發現，當濃度達到數字PCR的檢測下限時，實時熒光PCR的CT值均為35，處于結果判斷的臨界值，很難得到準確的結果，而相對的在利用數字 PCR 檢測體系對濃度較低的樣品進行檢測時，雖然陽性微滴數較少，但是可以得到準確的靶標分子拷貝數等數值，這個特性對于實現微量病原菌的快速準確檢測具有十分重要的意義[27]。數字PCR的絕對定量技術可用于對供試菌株死活的快速判定。作為全新的技術手段，數字PCR存在儀器昂貴、測試成本較高等問題[28]。因此，建議在對丁香假單胞菌豌豆致病變種的檢測中，可探索建立實時熒光PCR和數字PCR檢測方法，以實現快速準確鑒定目標菌種，并對供試菌株的活性進行鑒定。

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