在線稀釋進樣-電感耦合等離子體質譜法測定單個酵母細胞中痕量元素的研究

曹 陽， 康勤書， 李勝清*， 陳 浩

(華中農業大學理學院化學系，湖北武漢 430070)

無機元素在生命活動中參與遺傳信息轉錄及翻譯、神經信號傳遞、催化生物分子合成及代謝等多種過程。生物試樣中痕量元素分析是元素生物化學研究的基礎[1]。電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)因其靈敏度高、多元素同時測定能力強等優點，已成為痕量和超痕量元素分析最常用的檢測技術之一[2]。采用時間分辨模式，ICP-MS可以用來捕捉單個細胞內元素信號及差異，促進從單細胞水平上考察和理解痕量元素在細胞和生物體內的作用機理[3,4]。然而，以常規方式將細胞懸浮液試樣引入ICP-MS儀進行單細胞中元素測定時，尚存在細胞信號采集效率較低、細胞事件易重疊等問題。針對這些不足，近年來學者們進行了多種改進研究，例如，通過改進ICP-MS霧化室、霧化器或樣品捕獲技術來提高細胞信號采集效率[5 - 7]或通量[8，9]；通過微流控樣品引入技術減少細胞重疊、提高細胞引入效率等[6,10-13]。目前，為ICP-MS單細胞分析建立一種操作簡便、易行的細胞樣品引入技術仍是亟待解決的問題。

ICP-MS常用的雙通道霧化室適合于將納米尺度極微小均勻的單一水相氣溶膠引入矩管，同時將稍大尺寸液滴排入廢液，卻不適合將包含微米大小細胞的液滴送出霧化室，導致單細胞引入效率特別低。因此，本文擬建立一種基于在線稀釋進樣和單通道霧化室的單細胞懸浮液樣品引入技術，應用于ICP-MS測定單個酵母細胞中痕量元素的新方法，以提高ICP-MS在單細胞分析中的細胞采集效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS 7900，美國安捷倫科技有限公司)；四通閥為商品聚醚醚酮(Polyetheretherketone，PEEK)材質；進樣管線為全氟烷氧基樹脂(Polyfluoroalkoxy，PFA)材質，內徑為0.30、0.50 mm，外徑為1.60 mm；AB204/01電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KB3渦旋振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；SK3300LH超聲波清洗機(上海科導超聲儀器有限公司)；LXJ-IIB中速離心機(上海安亭科學儀器廠)；XSP-36光學顯微鏡(中國鳳凰光學有限公司)；CellmeterMini細胞計數儀(美國，Nexcelom公司)；UPR-II-10TN超純水儀(四川優普超純科技有限公司)；XFP02-B高精度注射泵(蘇州訊飛科學儀器有限公司)。

質譜調諧液、多元素標準溶液(美國安捷倫科技有限公司)；HNO3(99.999%，m/m)(美國Sigma-Aldrich公司)；NaCl、CuSO4·5H2O(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；酵母材料為商品級食用酵母粉和商品級食用富硒酵母粉(中國山東齊魯生物科技)；實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母細胞懸液的制備向干燥酵母粉(約40 mg)里加入40 mL超純水，渦旋混合3 min，得到酵母細胞懸浮液。將細胞懸浮液在5 000 r/min離心10 min，去除上清后再次加入40 mL 超純水重懸。用超純水將細胞洗滌3次，加入40 mL超純水渦旋混合3 min后靜置2 h，使未分散的顆粒和較大的酵母細胞簇沉淀在樣品管底部。取上清液稀釋到適宜濃度作為樣品溶液。酵母細胞樣品于實驗當天處理后使用。

1.2.2 自制單通道霧化室和在線稀釋裝置的設計參考ICP-MS儀標配的Scott雙通道霧化室和文獻報道[5]的高通量細胞引入系統，設計了一種單通道霧化室(人工吹制玻璃)，如圖1(a)和1(b)所示。為避免較大液滴進入等離子體，該霧化室中部呈漏斗形，使其有助于大液滴從廢液口排出。

在線稀釋裝置如圖1(c)和1(d)所示，以商品PEEK四通閥為十字通路[14]，分別以商品PFA管道輸送超純水和細胞懸浮液，并連接至霧化裝置。

圖1 單通道霧化室示意圖(a)和實物(b)；在線稀釋裝置示意圖(c)和實物(d)Fig.1 Schematic diagrams and real shots of single-channel spray chamber(a,b) and online-dilution sampling device(c,d)

1.2.3 ICP-MS檢測將富硒酵母細胞懸浮液(細胞密度為2.0×105cells/mL)使用在線稀釋裝置與單通道霧化室聯用的進樣裝置引入ICP-MS系統，等離子體功率1 550 W，流量15 L/min，采樣深度8 mm，設置積分時間0.1 ms，采用時間分辨模式測定酵母細胞中24Mg、31P、66Zn、78Se、63Cu 的信號值。

1.2.4 數據處理對檢測到的細胞信號原始數據基于三倍空白的標準偏差(3σ)迭代算法篩選背景值及信號值，然后用origin 2018對篩選出的細胞信號值進行峰分析，得到單個細胞信號的峰高、峰面積等數據，并做進一步的分析處理[15]。

2 結果與討論

2.1 單通道霧化室與Scott雙通道霧化室的比較

實驗選取濃度為10 μg/L的質譜調諧液(7Li、89Y、205Tl)為測試對象，分別通過總提升量和載氣流量參數優化來考察、比較兩種霧化室對ICP-MS靈敏度的影響。結果如圖2所示，對于兩種霧化室，總提升量和載氣流量對Li、Y、Tl信號的影響差異均不明顯，說明自制單通道霧化室和儀器標配雙通道霧化室的分析性能接近。當總提升量和載氣流量分別為200～400 μL/min和1.0～1.2 L/min時，目標元素信號強度較大。相比于雙通道霧化室，單通道霧化室增加了引入等離子體的液體質量和引入大液滴的風險。因此，后續實驗采用較低的200 μL/min為總提升量，并設置載氣流量為1.0 L/min。

圖2 不同總提升量(a)和載氣流量(b)條件下 7Li、89Y、205Tl對應Scott雙通道或單通道霧化室的響應值Fig.2 7Li,89Y,and 205Tl responses of Scott double-channel spray chamber and single-channel spray chamber at different total injection flow rates(a) or carrier gas flow rates(b)

2.2 在線稀釋裝置與單通道霧化室聯用的條件優化

實驗以酵母細胞31P元素為對象(細胞密度為1.0×106cells/mL,n=3,RSD=4.58%)，比較了在線稀釋條件下單通道與雙通道霧化室對單細胞信號采集的性能。結果表明，通過在線稀釋進樣，原樣品中緩沖鹽組分濃度被稀釋，因而信號基線明顯下降。但是單個細胞產生的信號強度沒有明顯改變。當總樣品提升量為200 μL/min時，ICP-MS測得的單細胞事件個數隨樣品流量在2～50 μL/min范圍內增大而增多。綜合考慮單位時間內細胞信號事件個數和基線降低效果，實驗選擇稀釋比為1∶20，即樣品流量為10 μL/min、總提升量為200 μL/min。結果如表1所示，在線稀釋裝置與單通道霧化室聯用的單細胞信號采集效率為31.3%，顯著大于雙通道霧化室的1.3%。這說明，盡管以均相的質譜調諧液為測試樣品時，單通道霧化室的分析性能與雙通道霧化室相當，但是當以多相的細胞分散液為測試對象時，單通道霧化室的分析性能顯著優于雙通道霧化室。

表1 不同霧化室的單細胞采集效率Table 1 Single cell detection ratio for different spray chambers

2.3 富硒酵母細胞中元素的檢測

在優化條件下，對富硒酵母中24Mg、31P、66Zn、78Se、63Cu等元素信號進行了檢測。測試樣品中Mg、P、Cu、Zn、Se信號的時間分辨質譜圖和頻數分布圖如圖3所示。由頻數分布圖可以看出，在酵母細胞中的元素含量，除Mg外，P、Cu、Zn、Se等都呈現為明顯的多峰分布趨勢，提示這些元素與酵母細胞大小和狀態之間可能存在關聯。這表明在線稀釋ICP-MS單細胞元素分析應用于細胞異質性研究具有較好的潛力。

圖3 富硒酵母細胞 24Mg、31P、66Zn、78Se、63Cu時間分辨質譜圖(A)和頻數分布圖(B)Fig.3 Time -resolved mass spectra(A) and histograms(B) of 24Mg,31P,66Zn,78Se,63Cu in selenium-enriched yeast cells

3 結論

本文提出的在線稀釋裝置設計簡單、易于操作，與單通道霧化室聯用，適合進行ICP-MS單細胞元素分析。以超純水在線稀釋的進樣方式有利于直接引入含有一定濃度緩沖鹽的細胞懸浮液樣品，降低樣品基質的干擾。本方法為ICP-MS單細胞元素分析應用于其它細胞的研究提供可行的樣品引入方式。