擬南芥細胞色素P450 707A3電化學傳感檢測脫落酸

王 政， 姜 楠， 吳云華*

(中南民族大學生命科學學院，湖北武漢 430074)

脫落酸(Abscisic Acid,ABA)是一種重要的植物信號分子,能調控很多植物生理過程，包括種子萌發、根系發育、葉片生長、細胞的程序性死亡等生理進程以及植物對逆境脅迫的應答[1]。ABA在植物體內的重要作用使其成為植物學領域研究熱點。因此，建立ABA的快速靈敏、高效準確檢測方法，研究植物體內ABA濃度的變化，對解析ABA的信號傳導機制具有重要意義[2]。當前ABA常用的檢測方法有免疫法和色-質聯用法。其中，免疫法主要有ELISA法[3]和電化學免疫傳感器法[4]。免疫法靈敏度較高，但抗體制備純化較為困難，而且很難排除ABA前體物、結構類似物引起的交叉反應。色-質聯用法因其高選擇性及高靈敏成為當前被廣泛采用的檢測方法[5]。但是在色-質聯用測定過程中都必須先分離提取植物組織的ABA，再定量檢測，費時費力，而且需要大型的儀器設備。電化學傳感器法具有儀器價格低廉、操作方便、檢測快速等優點，但是存在選擇性差的問題。酶電極利用酶的專一性，可以提高檢測的專一性，因而受到了廣泛關注，有望實現植物激素ABA的高特異性和高靈敏檢測[6]。

擬南芥細胞色素CYP 707A3是高等植物體內ABA羥基化失活途徑的關鍵酶，催化ABA生成活性較低的紅花菜豆酸，該酶促反應特異性高[7]。本實驗利用細胞色素CYP 707A3對ABA的特異催化作用，結合電化學傳感技術，制備了用于檢測ABA的生物傳感器。采用表面活性劑雙十六烷基磷酸(DHP)，制備類生物膜結構，固定CYP 707A3于熱裂解石墨電極表面，研究了CYP 707A3的電子傳遞行為，以及其對ABA的電化學催化過程，實現了ABA的特異檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

電化學工作站(上海辰華儀器公司，CHI660C)；標準三電極體系：CYP 707A3/DHP修飾的熱解石墨電極(PGE)為工作電極，甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑電極為對電極。

CYP 707A3膜蛋白的表達純化參照文獻報道[8],濃度按照文獻方法[9]測定為16.3 μmol/L。雙十六烷基磷酸(DHP)(Fluka)；脫落酸(ABA)、生長素、細胞分裂素、油菜素內酯(Sigma)；其他常用實驗試劑均購自國藥集團有限公司。水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 DHP膜及DHP-707A3修飾PGE的制備將PGE(直徑3 mm)于拋光布上用Al2O3粉末(粒徑為0.05 μm)充分拋光后，置于30%HNO3中超聲清洗1次，無水乙醇中超聲波清洗1次，二次蒸餾水中超聲清洗2次，每次1 min，室溫晾干。取10 μL CYP 707A3膜蛋白混懸液(pH=7.0的PBS混懸)，與10 μL 1 mg·mL-1DHP溶液混合均勻，用移液器吸取10 μL混合溶液于電極表面，4 ℃冰箱過夜干燥，得到CYP 707A3-DHP/PGE。以固定10 μL 1 mg·mL-1DHP溶液的DHP/PGE作為對照。

1.2.2 CYP 707A3 -DHP修飾PGE檢測ABA檢測池中加入5 mL 0.1 mol·L-1PBS，將三支電極置于檢測池中，不斷加入ABA溶液，磁力攪拌混合均勻后，進行循環伏安(CV)掃描，掃速為0.5 V·s-1。

1.2.3 CYP 707A3-DHP修飾PGE選擇性將修飾電極放入裝有5 mL 0.1 mol·L-1PBS的檢測池中，分別加入與ABA等濃度的反式玉米素(細胞分裂素)、生長素和油菜素內酯。采用CV法進行電化學檢測，掃速為0.5 V·s-1。重復實驗3次，取其平均值。

2 結果與討論

2.1 CYP 707A3的直接電化學行為研究

圖1為DHP/PGE和CYP 707A3-DHP/PGE在通氮除氧20 min的PBS中的CV圖，掃速為0.5 V·s-1。未固定蛋白的PGE未觀察到氧化還原峰(曲線a)；而固定有CYP 707A3的PGE有一對氧化還原峰(曲線b)，其氧化還原峰電位分別為-0.58 V和-0.50 V。上述結果表明，DHP固定在PGE表面不具有電化學信號，而CYP 707A3包埋在DHP膜內，實現了直接電化學。

圖1 無氧條件下0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)中DHP/PGE(a)和CYP 707A3-DHP/PGE(b)的循環伏安(CV)圖Fig.1 CVs of DHP/PGE(a) CYP 707A3-DHP(b) in 0.1 mol·L-1 oxygen-free PBS(pH=7.0)Scan rate:0.5 V·s-1.

將CYP 707A3-DHP置于pH=7.0的PBS中,在 0.1～1 V·s-1范圍內改變掃速,考察掃速對電化學行為的影響(圖2)。其氧化還原峰峰電位基本不變,氧化還原峰峰電流隨掃速的增加而增大,且與掃速呈良好的線性關系。表明CYP 707A3的電極反應由吸附控制[10]。

圖2 (A)無氧條件下CYP 707A3-DHP/PGE在不同掃速下的CV圖；(B)CYP 707A3氧化還原峰電流與掃速關系Fig.2 (A)CVs of CYP 707A3-DHP/PGE in PBS(pH=7.0 ) at the scan rate from 0.1 to 1.0 V·s-1;(B) The plot of cathodic and anodic peak currents vs the scan rate

根據公式：Г=Q/nFA，對CV圖的還原峰面積進行積分，可求得CYP 707A3在電極表面的電活性物質的量。此處，Г為電極表面的電活性物質的量；Q為涉及還原反應的電量；n為涉及電極反應的電子傳遞數目；F為法拉第常數；A為電極的面積,使用[Fe(CN)6]3-/4-可逆氧化還原電對求得為1.05 cm2。其電極表面的電活性物質的量為3.46×10-12mol·cm-2。實驗測得的數據是固定在電極表面DHP膜內的蛋白質總量的5%左右，說明在DHP膜內一些蛋白質沒有參與電極反應。

根據Laviron理論[11]，對于無擴散控制的CV圖，當nΔEp<200 mV(這里n為涉及電極反應的電子傳遞數目，ΔEp為氧化還原峰的電位差)，其電子傳遞速率ks由下式求得：ks=nFv/(RTm-1)。一般認為每一個血紅素基團參與電極反應只涉及一個電子，因此可認為CYP 707A3的n值為1，根據文獻報道[11]查得其m值為2.9。由此求得DHP膜內CYP 707A的電子傳遞速率ks=57±3 s-1，稍低于固定于黏土中的cytochrome P450 2B4的電子傳遞速率(ks=80 s-1[12])。

2.2 CYP 707A3-DHP/PGE電化學檢測ABA

將CYP 707A3-DHP/PGE放入pH=7.0的PBS中時，出現CYP 707A3的一對血紅素Fe(Ⅲ/Ⅱ)的氧化還原峰(圖3)。在有氧條件下，向電解池中不斷加入ABA溶液后，在-0.55 V 處還原峰電流不斷增加，同時伴隨著Fe(Ⅱ)的氧化峰電流的逐漸減小，而DHP/PGE無此現象。這些結果表明，圖3中的還原峰是CYP 707A3在有氧條件下催化氧化ABA引起的。

圖3 CYP 707A3-DHP/PGE在不同濃度ABA的pH=7.0 PBS中的CVFig.3 CVs of CYP 707A3-DHP/PGE in PBS (pH=7.0) with different concentration of ABA1-16:0,5,10,15,20,25,30,40,50,60,70,80,90,100,150,200 nmoL·L-1,respectively.

圖4為ABA濃度與相應的CYP 707A3-DHP/PGE催化還原峰電流變化值的關系圖。可以觀察到，當ABA的濃度高于70 nmol·L-1時，還原峰電流的變化與ABA濃度的關系趨于平穩狀態，符合Michaelis-Menten動力學機制的典型特征。從Lineweaver-Burk方程的電化學形式獲得表觀的Michaelis-Menten常數Kmapp，該常數成為酶對其底物親和力的量度。根據Lineweaver-Burk方程：1/Iss=1/Imax+Kmapp/Imaxc。其中Iss是添加ABA后的穩態電流，Imax是在飽和ABA濃度條件下測得的最大電流，c是測定中ABA的濃度。將相應數值代入上述方程，計算得到CYP 707A3-DHP/PGE的Kmapp值為77.075 nmol·L-1,低于溶液中CYP 707A3催化ABA的Km值(1.3 μmol·L-1[7])。表明固定于DHP膜內的CYP 707A3與ABA的親和性高。由圖4的內插圖可知：ABA的濃度在5～70 nmol·L-1范圍內，CYP 707A3-DHP/PGE的還原峰電流改變值與ABA的濃度呈線性關系，線性回歸方程為：y=-0.3056+0.0799x，相關系數R2=0.991，檢測限為0.16 nmol·L-1。

圖4 CYP 707A3-DHP/PGE還原峰電流差值與不同濃度ABA關系(內插圖：CYP 707A3-DHP/PGE還原峰電流差值與不同濃度ABA的線性關系)Fig.4 The relationship between the change of the reductive peak current of CYP 707A3-DHP/PGE and the concentration of ABA(The inset:the linear relationship between the change of the reductive peak of CYP 707A3-DHP/PGE and the concentration of ABA)

2.3 CYP 707A3-DHP/PGE的選擇性

在檢測池中加入與ABA相同濃度的油菜素內酯(BR)、異戊烯基腺嘌呤(CK)和生長素(IAA)，進行CV法檢測，3次重復實驗，選取ABA、BR、CK和IAA的50、100、150、200 nmol·L-14個濃度下，作還原峰電流差值圖與植物激素濃度關系對比圖，如圖5所示。當濃度為50 nmol·L-1時，ABA對應的峰電流差值明顯高于另外3種激素，且隨著濃度增加有明顯增大趨勢而CYP 707A3-DHP/PGE對另外3種激素信號響應很小。說明了ABA與CYP 707A3的識別和結合具有高度親和力和特異性，而對常見植物激素如生長素、細胞分裂素和油菜素內酯，CYP 707A3-DHP/PGE不具有電化學催化作用，表明CYP 707A3-DHP/PGE的選擇性良好。

圖5 CYP 707A3 -DHP/PGE的選擇性Fig.5 Selectivity of CYP 707A3-DHP/PGE

2.4 CYP 707A3-DHP/PGE的穩定性及重現性

將CYP 707A3-DHP/PGE于4 ℃保存，每天檢測其電流響應，15 d后，CYP 707A3-DHP/PGE的氧化峰電流保持原來的85%，CYP 707A3-DHP/PGE的還原峰電流保持原來的80%，該ABA傳感器良好的穩定性。對50 nmol·L-1的ABA在CYP 707A3-DHP/PGE上的響應進行7次重復測定，其相對標準偏差為5.6%，表明傳感器的精確度較高。同一支電極重復修飾CYP 707A3-DHP混合膜7次，分別檢測50 nmol·L-1的ABA，相對標準偏差為8.6%，顯示CYP 707A3-DHP傳感器具有較好的重現性。

3 結論

原核表達純化的細胞色素P450 707A3(CYP 707A3)，采用表面活性劑DHP固定于熱裂解石墨電極表面，固定在DHP膜內的CYP 707A3能夠實現直接電化學，在pH=7.0的PBS中，掃速為0.5 V·s-1時其氧化還原峰電位分別為-0.58 V和-0.50 V，電子傳遞速率ks=57±3 s-1。在有氧條件下CYP 707A3對ABA氧化催化，其還原峰電流的變化值與ABA濃度在5～70 nmol·L-1范圍內呈線性關系，可用于ABA的檢測。激素干擾實驗證明了CYP 707A3電化學催化檢測ABA具有高的特異性，而且此修飾電極具有較好的穩定性和重現性。