基于空心二硫化鉬納米球/金納米花的神經元特異性烯醇化酶光電化學免疫傳感器

劉仁喜， 王炎英， 劉 蔻， 黃雅嬌， 李海燕， 李春涯*

(1.中南民族大學化學與材料科學學院，湖北武漢 430074；2.溫州醫科大學藥學院，浙江溫州 325035)

光電化學免疫傳感器不僅兼具光學測定及電化學傳感的優勢，還因免疫識別(如抗原抗體反應)而具有高特異性。同時，光電化學免疫傳感器以光為激發源，電為輸出信號，激勵信號與輸出信號徹底分離，可有效克服背景信號干擾，顯示出超高靈敏度。此外，光電化學免疫傳感器還具有高選擇性、低背景信號、低成本等優勢，已廣泛用于腫瘤標志物等生物分子的檢測[1 - 3]。

近年來，具有類石墨烯二維納米結構的過渡金屬二硫屬化物，因其優良的光電特性而備受關注。MoS2作為過渡金屬二硫屬化物的典型代表，具有可調的帶隙結構，易剝離、易于功能化等特性，已被廣泛用于生物分析、光電化學傳感器、催化等領域[4 - 6]。目前MoS2的尺寸和形貌對其性能影響很大，納米片、納米管、納米棒、納米線、納米花等形貌各異的MoS2納米材料均已成功制備。納米MoS2的制備方法層出不窮，常見的有超聲剝離和溶劑熱法。其中，溶劑熱法具有操作簡單、結晶度良好、產物形貌可控、分散性好、成本低等優點，是MoS2合成的常見方法[7,8]。然而，相較于純MoS2，其復合材料往往性能更佳[9]。貴金屬納米顆粒與MoS2組裝是較為常見的復合材料制備方式[10,11]。與貴金屬納米金復合，可通過納米金的優良導電性及表面等離子共振效應，顯著增強MoS2的光電轉換效率[12 - 14]，提升檢測靈敏度，拓展其在光電化學傳感領域的應用前景。

本文以鉬酸銨為鉬源，硫脲為硫源，離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMimBF4])為溶劑和形貌控制劑，采用溶劑熱法制備空心MoS2納米球(MoS2NBs)。以乙二醇為溶劑，三乙醇胺為還原劑，采用水浴法制備金納米花(AuNFs)。將空心MoS2NBs與AuNFs組裝，制備AuNFs/MoS2納米復合材料。將AuNFs/MoS2納米復合材料修飾至玻碳電極(GCE，直徑3 mm)表面構建光電響應平臺，并用以負載神經元特異性烯醇化酶抗體(anti-NSE)，制備NSE光電化學免疫傳感器用于NSE定量分析，并成功用于臨床血樣中NSE的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司);6700F場發射掃描電鏡(日本，JEOL Ltd)；Multilab 2000X-射線光電子能譜(美國，VG);Tecnai G2 20ST透射電子顯微鏡(捷克,FEI);D8 X射線衍射儀(德國,Bruker公司)。

鉬酸銨(阿拉丁);硫脲(上海試劑一廠);1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMimBF4])(上海畢得醫藥科技有限公司);(NH4)6Mo7O24·4H2O、抗壞血酸、戊二醛溶液(25%)、三乙醇胺、L-組氨酸、葡萄糖、Na2HPO4、KH2PO4、HAuCl4(國藥集團化學試劑有限公司)；牛血清白蛋白(BSA)(上海普飛生物技術有限公司)；神經元特異性烯醇化酶(NSE)、神經元特異性烯醇化酶抗體(anti-NSE)(北京博奧森生物技術有限公司)。其它試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 實驗條件

1.2.1 空心MoS2NBs將(NH4)6Mo7O24·4H2O(0.5 mmol，618 mg)和硫脲(14.0 mmol，1.0 g)溶于5 mL 超純水中，超聲混勻，再向混合溶液中加入10 mL離子液體[BMimBF4]，攪拌30 min，混合均勻后，轉移至25 mL高壓反應釜的聚四氟乙烯內襯中，密閉后置于180 ℃烘箱中反應18 h，冷卻至室溫，離心洗滌，固體產物即為空心MoS2NBs，分散于超純水中備用。

1.2.2 AuNFs制備將20 mL乙二醇置于100 mL圓底燒瓶，放入40 ℃水浴中，隨后將200 μL 1%的HAuCO4水溶液加入到20 mL乙二醇中，緩慢攪拌下加入2.5 mol·L-1新制備的三乙醇胺溶液，反應60 min，11 000 r·min-1離心10 min，用超純水離心洗滌數次，得到AuNFs，分散于超純水中備用。

1.2.3 AuNFs/MoS2納米復合材料制備分別將新制備的AuNFs、空心MoS2NBs分散到超純水中配成1 mL分散液，然后，將二者混合，在300 r·min-1下攪拌10 h，完成自組裝過程，在離心作用下，以超純水洗凈，制備出AuNFs/MoS2納米復合材料，將AuNFs/MoS2納米復合材料分散到超純水中備用。

1.2.4 光電化學免疫傳感器制備以Al2O3懸濁液拋光處理GCE，并依次在HNO3(1+1)、乙醇和水中超聲清洗，室溫下晾干。將6 μL AuNFs/MoS2納米復合溶液滴涂至潔凈的GCE表面，室溫下晾干，得到AuNFs/MoS2/GCE光電響應界面。隨后，在AuNFs/MoS2/GCE表面滴涂6 μL濃度為5 μg·mL-1的anti-NSE溶液，室溫晾干后，將其轉移到裝有戊二醛蒸氣的密閉容器中交聯2 min，以增強抗體在生物傳感界面的穩定性。隨后，將生物傳感界面在BSA溶液中孵育30 min，以封閉殘余的醛基，超純水洗凈，獲得光電化學免疫傳感器，可表示為anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE。

1.2.5 電化學和光電化學測試以LED白光燈(5 W)為激發光源，采用安培技術進行光電化學測量，記錄電流-時間(i-t)曲線。使用輻射計(北京師范大學光電儀器廠)檢測白光LED燈的光強度，大約為180 mW·cm-2。所有光電化學測量均在磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.0)中進行，以0.1 mol·L-1抗壞血酸為電子供體，工作電極電位設定為0.05 V(vs.SCE)。在5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)和0.1 mol·L-1KCl的混合溶液中，采用電化學交流阻抗譜(EIS)表征傳感界面的特性，頻率控制在0.1 Hz至100 kHz范圍內，振幅為5 mV，初始電位為開路電位。對于NSE的測定，先將免疫傳感器浸入NSE溶液中，在35 ℃下孵育30 min。隨后用PBS洗滌，除去免疫傳感器表面物理吸附的NSE。

2 結果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 透射電子顯微鏡(TEM)表征如圖1所示，采用TEM表征MoS2NBs、AuNFs和AuNFs/MoS2納米復合材料的形貌。從圖1a可知，空心MoS2具有球狀結構，同時球的中間部位呈空心透明狀，表明成功制備空心MoS2NBs。如圖1b所示，制備的AuNFs具有均勻的花朵狀結構，其直徑在105～155 nm范圍內。由圖1c可知，AuNFs緊密附著在空心MoS2NBs的表面，表明成功將二者復合。AuNFs可提供大的比表面積和更多的活性位點，以固定NSE抗體，從而提高光電免疫傳感器的選擇性和靈敏度。

圖1 空心MoS2NBs(a)、AuNFs(b)和AuNFs/MoS2納米復合材料(c)的透射電子顯微鏡(TEM)圖Fig.1 TEM images of hollow MoS2 NBs(a),AuNFs(b) and AuNFs/MoS2 nanocomposites(c)

2.1.2 X射線衍射(XRD)表征采用XRD表征AuNFs/MoS2納米復合材料的晶體結構。在圖2a中，AuNFs/MoS2納米復合材料的衍射峰，分別對應于MoS2晶體的(002)、(100)晶面和AuNFs的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，表明成功制備AuNFs/MoS2納米復合材料。

2.1.3 X射線光電子能譜(XPS)表征采用XPS表征AuNFs/MoS2納米復合材料的化學組成。如圖2b所示，結合能的峰值位于84.58 eV、162.1 eV、230.47 eV、284.83 eV和530.94 eV，分別歸因于Au 4f、S 2p、Mo 3d、C 1s和O 1S電子能級，由此可知AuNFs/MoS2納米復合材料中存在Au、Mo、S元素，表明AuNFs成功組裝至空心MoS2NBs表面。

2.1.4 能量色散X射線光譜(EDS)表征以EDS表征材料元素組成。圖2c表明空心MoS2NBs由Mo和S兩種元素組成，定量計算表明Mo與S的原子比約為2.33∶1，與MoS2的化學計量比接近，表明成功制備空心MoS2NBs。圖2d表明AuNFs/MoS2納米復合材料由Mo、S和Au元素組成，表明成功制備該納米復合材料。

圖2 XRD(a)、XPS(b)表征AuNFs/MoS2納米復合材料;EDS表征MoS2(c)和AuNFs/MoS2納米復合材料(d)Fig.2 Characterization of AuNFs/MoS2 nanocomposite with XRD(a) and XPS(b);Characterizations of MoS2(c) and AuNFs/MoS2 nanocomposites(d) with EDS

2.2 光電化學免疫傳感器表征

2.2.1 掃描電鏡(SEM)表征采用SEM表征傳感器制備過程中各界面的表面形貌。由圖3a可知，裸露的GCE表面為光滑鏡面。圖3b為AuNFs/MoS2/GCE界面的形貌圖，可以清楚地觀察到空心MoS2NBs和AuNFs，AuNFs緊密附著于空心MoS2NBs表面。空心MoS2NBs表面修飾的AuNFs可以提供更多的活性位點以固載anti-NSE，并有助于增加它的固定量，從而提高免疫反應性能。將anti-NSE修飾在AuNFs/MoS2/GCE界面后，傳感界面形貌發生了顯著變化，其表面變得模糊，表明anti-NSE已成功固載至AuNFs/MoS2/GCE界面(圖3c)，即成功制備出光電化學免疫傳感平臺。

圖3 GCE(a)、AuNFs/MoS2/GCE(b)和anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(c)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.3 SEM images of a bare GCE(a),AuNFs/MoS2/GCE(b) and anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(c)

2.2.2 傳感界面表征圖4A為MoS2/GCE(a)和AuNFs/MoS2/GCE(b)的光電流響應曲線，其光電流分別為1.49 μA(a)和12.32 μA (b)。當AuNFs存在時，空心MoS2NBs的光電流響應顯著增強，歸于AuNFs的等離子體共振效應和優異的電子傳輸性能。結果表明，AuNFs復合至空心MoS2NBs表面可有效改善其光電流響應性能。電化學交流阻抗譜(EIS)是表征免疫傳感器制備過程中各界面特性的典型策略。圖4B為K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]在MoS2/GCE(a)和AuNFs/MoS2/GCE(b)上的Nyquist曲線。Nyquist曲線的半圓形部分對應于擴散控制過程，其直徑對應于界面的電荷轉移電阻(Rct)。比較圖4B中的曲線a、b可知，曲線a的半圓直徑明顯大于曲線b，表明AuNFs可促進K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]在電極界面的電荷傳輸。

圖4 MoS2/GCE(a)和AuNFs/MoS2/GCE(b)的光電流響應(A)和Nyquist曲線(B)Fig.4 Photocurrent responses(A) and Nyquist plots(B) of a MoS2/GCE(a) and an AuNFs/MoS2/GCE(b)

圖5A為K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]在GCE(a)、AuNFs/MoS2/GCE(b)、anti-NSE/AuNFs/MoS2/GCE(c)、anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(d)和NSE/anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(e)上的Nyquist曲線。當anti-NSE固定在AuNFs/MoS2/GCE界面上，由于anti-NSE對K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]探針的電子傳輸和質量傳輸的阻滯作用，Rct值急劇增加。隨后依次用戊二醛和BSA處理anti-NSE/AuNFs/MoS2/GCE，由于相同原因，Rct值相應增加。用于NSE測定時，將光電化學免疫傳感器在0.1 ng·mL-1NSE溶液中孵育30 min，在完成孵育過程后，半圓直徑顯著增強，表明NSE已被選擇性識別至傳感界面。

抗壞血酸(0.1 mol·L-1)可與光生空穴發生反應，阻止電子-空穴對重新結合，從而增強光電流響應。在傳感器逐步構建過程中，使用計時電流法用于記錄光電化學傳感界面的光電流。圖5B為裸GCE(a)、AuNFs/MoS2/GCE(b)、anti-NSE/AuNFs/MoS2/GCE(c)、anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(d)和NSE/anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(e)的光電流曲線。裸GCE的光電響應非常微弱，其產生的背景干擾可忽略不計。當用AuNFs/MoS2納米復合材料修飾GCE表面時，光電流明顯增加，達到12.32 μA，表明AuNFs/MoS2納米復合材料可以有效提升光電轉換效能。隨后，依次考察修飾anti-NSE、以BSA阻斷非特異性位點、選擇性識別NSE各過程所致界面的光電流響應，發現光電流不斷減小。光電流的變化趨勢與交流阻抗譜吻合，表明成功組裝各傳感界面。

圖5 GCE(a)、AuNFs/MoS2/GCE(b)、anti-NSE/AuNFs/MoS2/GCE(c)、anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(d)和NSE/anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(e)在 5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中的Nyquist曲線(A)和在白光照射下的光電流曲線(B)Fig.5 Nyquist plots(A) and photocurrent responses(B) of a GCE(a),an AuNFs/MoS2/GCE(b),an anti-NSE/AuNFs/MoS2/GCE(c),an anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(d) and a NSE/anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE(e)

2.3 實驗條件優化

當被白光照射時，空心MoS2NBs可被激發產生電子-空穴對，光生空穴可被電子給體抗壞血酸捕獲，促進電子-空穴對分離，以產生光電流。因此，抗壞血酸是影響AuNFs/MoS2/GCE納米復合材料光電轉換效率的關鍵因素。從圖6a可以看出，光電流響應隨著抗壞血酸濃度從0增加到0.1 mol·L-1而相應增加。當抗壞血酸濃度為0.1 mol·L-1時可獲得最大光電流。然而，當抗壞血酸濃度高于0.1 mol·L-1時，隨抗壞血酸濃度增加，光電流響應逐漸降低。高濃度抗壞血酸可阻止光生電子與電極表面之間的電子轉移，從而導致光生電子-空穴對重新組合，致使光電流減小。

在孵育NSE過程中，孵育時間會影響NSE在傳感界面的識別量。如圖6b所示，在0.1 ng·mL-1NSE溶液中，當孵育時間從15 min增加到30 min時，NSE可通過特異性識別作用結合到傳感界面，光電響應差值逐漸增加，30 min時光電響應差值達最大值，30 min后光電響應差值基本保持不變，表明光電化學免疫傳感器的抗原抗體特異性識別作用已經達到飽和。因此，最佳的孵育時間為30 min。

在孵育NSE過程中，孵育溫度會影響NSE抗體的生物學活性，并進一步影響anti-NSE與NSE間的免疫識別反應。如圖6c所示，在0.1 ng·mL-1NSE溶液中，當孵育溫度從25 ℃增加到35 ℃時，anti-NSE活性增加，特異性識別作用增強，NSE在傳感界面富集量增加，光電響應差值逐漸增加，35 ℃時，光電響應差值達到最大值；當孵育溫度超過35 ℃后，anti-NSE的生物活性降低，光電響應差值逐漸減小。因此，最佳孵育溫度為35 ℃。

圖6 AuNFs/MoS2/GCE的光電流響應與抗壞血酸(AA)濃度(a)及其在0.1 ng·mL-1NSE溶液中的孵育時間(b)和孵育溫度(c)之間的關系Fig.6 Dependence of the photocurrent response of an AuNFs/MoS2/GCE on the ascorbic acid concentration(a),and the photocurrent decline of anti-NSE/AuNFs/MoS2/GCE upon interaction with NSE at different incubation time(b) and incubation temperature(c)

2.4 線性范圍及檢出限

在最優化條件下，光電流隨NSE濃度增加成比例降低。光電流變化(ΔI=I0-I，I0和I表示將NSE結合至免疫傳感界面之前和之后的光電流響應)與NSE濃度對數(lgc)呈線性相關，線性范圍為4.0 pg·mL-1至2.5 ng·mL-1，線性回歸方程為：ΔI=0.612lgc+4.06(R2=0.981)，檢出限(S/N=3)為1.83 pg·mL-1。

2.5 傳感器性能測試

以5.0 ng·mL-1抗壞血酸(AA)、人血清白蛋白(HSA)、L-組氨酸(L-His)、心肌肝蛋白(cTnI)和葡萄糖(Glc)作為干擾物，考察光電化學免疫傳感器對0.1 ng·mL-1NSE的光電流響應。如圖7所示，傳感器對NSE及其與干擾物共存時的光電流變化可以忽略，這意味著光電化學免疫傳感器對NSE的測定具有較好的選擇性。

圖7 傳感器選擇性測試Fig.7 Selectivity of the PEC immunosensor towards NSE

分別制備5支基于anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE免疫傳感器，在4 ℃下存儲19 d，并于存儲前、后分別測定0.1 ng·mL-1NSE，用于評估光電化學免疫傳感器的穩定性。存儲后，測量值可保持初始值的97.33%，表明光電化學免疫傳感器在該條件下可保持良好的穩定性。采用獨立制備的4支基于anti-NSE(BSA)/AuNFs/MoS2/GCE，測定0.1 ng·L-1NSE的相對標準偏差(RSD)為3.50%，表明該光電化學免疫傳感器有良好的制備重現性。

2.6 實際樣品檢測

為評估該光電化學免疫傳感器對NSE測定的準確性，將其用于測定臨床血清樣品中的NSE，并與臨床檢測的電化學發光(ECL)免疫法測量結果進行比較。稀釋后臨床血清樣品中NSE濃度測定結果如表1所示。光電化學法和電化學發光法測定結果的相對偏差小于3.88%，表明具有一致性。此外，還采用加標回收實驗以分析光電化學免疫傳感器的準確性。表2為臨床血清樣品中NSE的加標回收率，其值介于96.6%至102%之間，表明光電化學免疫傳感器具有用于臨床檢測的潛在價值。

表1 光電化學免疫傳感器和ECL法測定臨床血清樣品中NSE(n=3)Table 1 Determination of NSE in clinical serum samples using the photoelectrochemical immunosensor and ECL immunoassay(n=3)

表2 光電化學免疫傳感器測定臨床血清樣品中NSE的回收率(n=3)Table 2 Recoveries for determining NSE in clinical serum samples using the photoelectrochemical immunosensor(n=3)

3 結論

將AuNFs與空心MoS2NBs復合制備AuNFs/MoS2納米復合材料，基于AuNFs優異的電子傳輸性能和表面等離子體共振效應，提升半導體空心MoS2NBs的光電轉換效率，并將AuNFs/MoS2納米復合材料作為光電活性材料，固載神經元特異性烯醇化酶抗體(anti-NSE)，構建NSE光電化學免疫傳感器，實現NSE的高效檢測。將該光電化學免疫傳感器用于臨床血樣中NSE檢測，與電化學發光法檢測結果一致，表明該傳感器在臨床檢測上具有潛在應用價值。