基于蘆丁分子印跡殼聚糖-離子液體功能化石墨烯-碳納米管的電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用

王 苑, 趙發(fā)瓊, 曾百肇*

(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

蘆丁廣泛存在于蕎麥、漿果及草藥中，因其具有抗氧化、抗炎、抗菌等作用而常被用于一些疾病的治療[1]。常見(jiàn)的蘆丁檢測(cè)方法有化學(xué)發(fā)光法[2]、高效液相色譜法[3]、分光光度法[4]和毛細(xì)管電泳法[5]等。此外，由于蘆丁具有良好的電活性，因此，用電化學(xué)法直接檢測(cè)蘆丁也有不少報(bào)道[6]。采用電化學(xué)傳感器檢測(cè)時(shí)，為了提高選擇性常需引入分子識(shí)別元素。分子印跡聚合物(MIPs)因有良好的選擇性、化學(xué)和物理穩(wěn)定性等而常被用于此目的[7]。MIPs的制備方法有化學(xué)、電化學(xué)和物理方法等，其中物理方法相對(duì)較簡(jiǎn)便。物理方法印跡的單體一般為帶功能基的大分子。

本工作中，我們用簡(jiǎn)單的一步水熱法制備了具有3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的離子液體功能化石墨烯-碳納米管復(fù)合材料(GN-CNTs-IL)。然后，將殼聚糖與蘆丁混合，再進(jìn)一步與GN-CNTs-IL混合，加戊二醛交聯(lián)。以此制備分子印跡殼聚糖電化學(xué)傳感器，用于蘆丁的檢測(cè)。結(jié)果表明，該傳感器表現(xiàn)出良好的分析性能，而目前尚無(wú)采用該方法制備傳感器的報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，實(shí)驗(yàn)采用三電極體系:以修飾玻碳電極(GCE，直徑3 mm)為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。Zeiss掃描電子顯微鏡(SEM)(英國(guó)，卡爾蔡司公司)；JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)(日本，電子株會(huì)社)；Bruker D8 X-射線衍射(XRD)儀(德國(guó))，配Cu Kα輻射(40 kV，40 mA)。

氧化石墨烯(GO，99%)和碳納米管(CNTs，95%)購(gòu)自南京先鋒納米材料科技有限公司；蘆丁購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，殼聚糖(CS)(脫乙酰度≥95%，粘度100～200 mpa.s)和戊二醛(GA，50%)購(gòu)于上海阿拉丁有限公司。0.10 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=5.5)由Na2HPO4和NaH2PO4配制。其它試劑均為分析純，所有溶液均用超純水配制。

1.2 GN-CNTs-IL復(fù)合材料的制備

首先，在攪拌下向35 mL GO水分散液中(0.50 mg/mL)加入21.0 mg的離子液體1-氨丙基3-甲基咪唑溴([APMIM]Br)，此時(shí)分散液產(chǎn)生大量絮狀沉淀。接著，加入30 mg KOH，超聲30 min，分散液變均一透明。然后，加入10 mg CNTs且超聲混合2 h。再將上述混合液轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，在溫度180 ℃下反應(yīng)12 h。待反應(yīng)釜溫度降至室溫后，所得產(chǎn)物依次用乙醇和超純水清洗至中性，真空干燥即得GN-CNTs-IL。

1.3 分子印跡電化學(xué)傳感器的制備

將10 mg CS粉末溶于5 mL 0.2%HAc溶液中，在室溫下超聲處理1 h制備CS溶液。取4.95 mL CS溶液和50 μL蘆丁溶液(0.010 mol/L)于小燒杯中，攪拌3 h后，加入10 mg GN-CNTs-IL復(fù)合物，超聲20 min。再加入5 μL交聯(lián)劑GA(1%，V/V)，并在室溫下繼續(xù)攪拌30 min。產(chǎn)物冷凍干燥后配制成2.0 mg/mL的溶液，然后取6 μL分散液滴加到GCE上，自然干燥。接著，在磁力攪拌下用0.05 mol/L NaOH溶液處理電極5 min以去除蘆丁分子。最后，所得電極(MIPs/GN-CNTs-IL/GCE)用超純水洗滌，干燥備用。用相同方法制備非印跡電極，記為NIPs/GN-CNTs-IL/GCE；不加GN-CNTs-IL復(fù)合物用同樣的方法制備MIPs/GCE。

1.4 電化學(xué)檢測(cè)

將洗脫后的修飾電極浸入含一定濃度蘆丁的0.10 mol/L PBS(pH=5.5)中，開(kāi)路下富集10 min，再在0.2～0.8 V范圍內(nèi)進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，測(cè)量在0.5 V處出現(xiàn)的蘆丁氧化峰。電化學(xué)阻抗(EIS)實(shí)驗(yàn)在含有0.10 mol/L KCl和5.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行。

1.5 樣品制備

蕎麥茶樣品的制備參考文獻(xiàn)方法[17]，首先用研缽將樣品研成粉末，然后用乙醇超聲提取粉狀樣品(0.100 g)，離心后將上清液置于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，放在4 ℃冰箱中避光保存。復(fù)方蘆丁片研碎后分散于甲醇中，超聲10 min，離心后取1 mL溶液用甲醇稀釋至10 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIPs/GN-CNTs-IL/GCE的表征

不同材料的形貌和結(jié)構(gòu)如圖1所示。GN為表面光滑有褶皺的片層結(jié)構(gòu)，引入IL后褶皺變多，層狀更明顯，這與IL在一定程度上可阻止GN團(tuán)聚有關(guān)[18]。CNTs通過(guò)π-π相互作用進(jìn)入GN片層間，使得GN-CNTs-IL呈多孔結(jié)構(gòu)。經(jīng)GA交聯(lián)后的殼聚糖印跡膜MIPs/GN-CNTs-IL(圖1D)保持了GN-CNTs-IL的多孔結(jié)構(gòu)，但孔徑更小更密。圖1E和圖1F分別是GN-IL和GN-CNTs-IL的TEM圖，表明卷曲的CNTs雜亂地連接在石墨烯片層間，而IL則附著在GN褶皺上和CNTs表面。

圖1 GN(A)、GN-IL(B)、GN-CNTs-IL(C)、MIPs/GN-CNTs-IL/GCE(D)的SEM圖像；GN-IL(E)和GN-CNTs-IL(F)的TEM圖像Fig.1 SEM images of GN(A),GN-IL(B),GN-CNTs-IL(C) and MIPs/GN-CNTs-IL/GCE(D);TEM images of GN-IL(E) and GN-CNTs-IL(F)

圖2所示為制備的幾種電化學(xué)傳感器的EIS譜圖。可見(jiàn)，GN-CNTs-IL/GCE的電子傳遞電阻很小；當(dāng)有了印跡層后，阻抗較大(曲線b,900 Ω)，表明印跡層導(dǎo)電性較差，對(duì)[Fe(CN)6]3-/4-的電化學(xué)反應(yīng)有較大阻礙作用。但當(dāng)洗脫模板后，阻抗減小(曲線c，約650 Ω)，說(shuō)明洗脫產(chǎn)生的位點(diǎn)可為探針提供傳輸通道。需要指出的是，其阻抗仍然比GN-CNTs-IL/GCE的大很多，表明NaOH溶液對(duì)蘆丁有良好的溶解作用但又不破壞CS膜[19]。當(dāng)把電極再次浸入到10 μmol/L蘆丁的PBS中富集之后,MIPs/GN-IL-CNTs/GCE阻抗值增大至約800 Ω(曲線d)，這是由于模板分子占據(jù)了識(shí)別空腔，阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-探針的電化學(xué)反應(yīng)。這些表明，GN-CNTs-IL有良好的電子傳遞能力，蘆丁分子被成功印跡在復(fù)合膜中。

圖2 不同電極在0.10 mol/L KCl-5.0 mmol/L[Fe(CN)6]-3/-4溶液中的EIS譜圖Fig.2 EIS of different electrodes in 0.10 mol/L KCl containing 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]-3/-4(a)GN-IL-CNTs/GCE;(b)MIP/GN-IL-CNTs/GCE before elution;(c)MIP/GN-IL-CNTs/GCE after elution;(d)MIPs/GN-IL-CNTs/GCE(rebinded rutin) and (e)NIPs/GN-IL-CNTs/GCE before elution.

2.2 蘆丁在不同電極上的響應(yīng)

蘆丁在不同電極上的DPV曲線如圖3A所示。它在GN/GCE、IL/GCE和CNTs/GCE上都有比較明顯的氧化峰，與GN、IL和CNTs良好的導(dǎo)電、催化性有關(guān)。當(dāng)GN、CNTs與IL復(fù)合后，蘆丁的峰電流顯著增大，這是由于IL的引入不僅改善了GN、GN-CNTs在水中的分散性，而且使材料結(jié)構(gòu)疏松而具有更大比表面積，從而提高了靈敏度[20]。與GN-IL/GCE相比，引入CNTs后，蘆丁在GN-CNTs-IL/GCE上的峰電流進(jìn)一步增大，這是因?yàn)樾纬闪吮砻娣e更大的多孔結(jié)構(gòu)。圖3B是蘆丁在GCE、MIPs/GCE、MIPs/GN-CNTs-IL/GCE、NIPs/GN-CNTs-IL/GCE和GN-CNTs-IL/GCE上的DPV圖。在裸GCE上有一個(gè)很小的氧化還原峰，來(lái)自蘆丁中酚羥基的氧化還原。在MIPs/GCE上的峰電流有所增加，但增幅較小。與NIPs/GN-CNTs-IL/GCE相比，MIPs/GN-CNTs-IL/GCE對(duì)蘆丁的響應(yīng)明顯增強(qiáng)，峰電流是非印跡時(shí)的4～5倍，這是由于MIPs對(duì)蘆丁分子的選擇性吸附所致。蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的氧化峰電流是MIPs/GCE上的5～6倍，這與GN-CNTs-IL表面積大、導(dǎo)電、催化性能好有關(guān)。而相同濃度的蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE和GN-CNTs-IL/GCE上的氧化峰電流差別不大，說(shuō)明蘆丁印跡CS膜上的有效印跡位點(diǎn)多且導(dǎo)電性良好。

圖3 (A)蘆丁在IL/GCE(a)、GN/GCE(b)、CNTs/GCE(c)、GN-IL/GCE(d)和GN-IL-CNTs/GCE(e)上的DPV圖；(B)蘆丁在GCE(a)、MIPs/GCE(b)、NIPs/GN-IL-CNTs/GCE(c)、MIP/GN-IL-CNTs/GCE(d)和GN-IL-CNTs/GCE(e)上的DPV圖Fig.3 (A) DPV of rutin at IL/GCE(a),GN/GCE(b),CNTs/GCE(c),GN-IL/GCE(d) and GN-IL-CNTs/GCE(e);(B) DPV of rutin at GCE(a),MIPs/GCE(b),NIPs/GN-IL-CNTs/GCE(c)，MIPs/GN-IL-CNTs/GCE(d) and GN-IL-CNTs/GCE(e)Supporting electrolyte:0.10 mol/L PBS(pH=5.5);accumulation time:600 s;scan rate:50 mV/s.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 離子液體濃度的選擇IL功能化對(duì)改善GN-CNTs在水中的分散性有重要作用。GO中存在大量具有活性的環(huán)氧基團(tuán)[21]，在親核試劑1-氨丙基3-甲基咪唑溴([APMIM)Br])和KOH存在的情況下，GO的環(huán)氧基可發(fā)生親核開(kāi)環(huán)反應(yīng)。同時(shí)，雙親性的GO -IL可促進(jìn)CNTs在水中的分散，形成分散均勻的GO -IL-CNTs混合液，在180 ℃反應(yīng)釜中經(jīng)12 h的高溫高壓水熱過(guò)程后，轉(zhuǎn)化為GN-CNTs-IL復(fù)合物。IL一方面增加了親水性，另一方面引起GN層間靜電排斥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)IL濃度從0 mg/mL增大至0.6 mg/mL時(shí)，蘆丁在所得MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的響應(yīng)電流逐漸增大；當(dāng)IL濃度超過(guò)0.6 mg/mL時(shí)，其響應(yīng)電流又降低(圖4A)。這是因?yàn)楫?dāng)IL濃度過(guò)大時(shí)，GN-CNTs分散度隨之降低且不利于模板分子的洗脫。因此，實(shí)驗(yàn)選用0.6 mg/mL IL。

2.3.2 殼聚糖濃度選擇考察了CS濃度對(duì)蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的峰電流的影響。取4.95 mL不同濃度的CS溶液和50 μL蘆丁溶液(0.010 mol/L)混合，當(dāng)CS濃度從0.1%(V/V)逐漸增大到0.8%時(shí)，蘆丁的峰電流先增加，然后下降，在0.2%時(shí)達(dá)最大值。這主要是由于高CS濃度會(huì)引起溶脹，增加膜的厚度，阻礙電子傳遞。但過(guò)低的CS濃度使印跡位點(diǎn)減少。因此，以0.2%CS用于制備印跡膜。

2.3.3 緩沖體系pH的影響緩沖體系的pH值對(duì)蘆丁的電化學(xué)行為和聚合物膜的穩(wěn)定性有一定影響。如圖4B所示，蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的峰電流隨緩沖體系pH的增大先增加，然后逐漸降低。這是因?yàn)樘J丁的氧化過(guò)程有質(zhì)子參與[22]，pH過(guò)小或過(guò)高不利于電化學(xué)反應(yīng)。另外，pH過(guò)小CS膜不太穩(wěn)定。因此選用pH=5.5的PBS為支持電解質(zhì)。

2.3.4 MIPs/GN-CNTs-IL滴涂量的影響隨著MIP/GN-CNTs-IL(2 mg/mL)用量從4 μL增至12 μL，峰電流先增大后減小，在滴涂量為6 μL時(shí)峰電流達(dá)到最大值。這是因?yàn)槠鸪蹼S滴涂量增加，特異性識(shí)別位點(diǎn)增多；但當(dāng)MIPs/GN-CNTs-IL的滴涂量過(guò)大時(shí)，有效位點(diǎn)數(shù)目基本不再增加，但膜厚增加阻礙電子傳遞，反而使響應(yīng)電流變小。而當(dāng)MIPs/GN-CNTs-IL的濃度大于2 mg/mL，印跡材料易發(fā)生表面脫落現(xiàn)象。因此，選擇6 μL 2 mg/mL MIPs/GN-CNTs-IL修飾GCE。

2.3.5 蘆丁與殼聚糖質(zhì)量比的影響保持CS與蘆丁的總質(zhì)量不變，改變它們的比例，制備修飾電極(圖4C)。結(jié)果表明，蘆丁與CS的質(zhì)量比由1∶50增加到1∶4時(shí)，所得MIPs/GN-CNTs-IL/GCE對(duì)蘆丁的響應(yīng)電流先增加后降低，在1∶30時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)對(duì)應(yīng)的摩爾比約為1∶200。這無(wú)疑與印跡位點(diǎn)數(shù)目和膜結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。比例太高和太低時(shí)，印跡位點(diǎn)數(shù)目均較少，只有在合適比例時(shí)才較多。此外，比例低時(shí)復(fù)合印跡膜結(jié)構(gòu)變得比較致密，不利于傳質(zhì)。因此，選擇質(zhì)量比為1∶30制備印跡電極。

圖4 離子液體的濃度(A)、溶液pH(B)和蘆丁與殼聚糖的質(zhì)量比(C)對(duì)蘆丁峰電流的影響Fig.4 Influence of IL concentration(A),solution pH(B),and mass ratio of rutin to CS (C) on peak current Solution conditions:5.0 μmol/L rutin+0.10 mol/L PBS(pH=5.5);scan rate:50 mV/s.

2.3.6 洗脫時(shí)間和吸附時(shí)間的影響考察了洗脫時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫時(shí)間從3 min增至11 min時(shí)，傳感器對(duì)蘆丁的電流響應(yīng)先增加，然后略有下降。這是因?yàn)檩^短的洗脫時(shí)間導(dǎo)致洗脫不完全，而過(guò)長(zhǎng)的洗脫時(shí)間可能會(huì)由于機(jī)械攪拌而影響MIPs穩(wěn)定性，因此選擇洗脫5 min。此外，還優(yōu)化了富集時(shí)間。對(duì)于5.0 μmol/L蘆丁，開(kāi)路吸附10 min后峰電流達(dá)到最大。因此，在測(cè)量前進(jìn)行10 min的富集。

2.4 蘆丁的電化學(xué)檢測(cè)

在上述優(yōu)化條件下，記錄了傳感器MIPs/GN-CNTs-IL/GCE對(duì)不同濃度蘆丁的DPV響應(yīng)曲線(圖5A)。隨著蘆丁濃度從0.010 μmol/L增大到200 μmol/L，峰電流先急劇增大后再相對(duì)平緩增大，分別與蘆丁濃度在0.010～1.0 μmol/L和1.0～200 μmol/L兩段范圍內(nèi)成線性關(guān)系(圖5B)，線性方程分別為：IP(μA)=17.54c(μmol/L)+4.331(R2=0.9967);IP(μA)=0.1169c(μmol/L)+21.91(R2=0.9915)，檢出限則達(dá)到6 nmol/L。

圖5 (A)蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的DPV圖(蘆丁濃度從a到l:0.01，0.1，0.5，0.7，1,10，50，100，150，200 μmol/L；(B)蘆丁的校準(zhǔn)曲線Fig.5 (A)DPV of rutin at MIPs/GN-CNTs-IL/GCE;(B)Calibration curve(rutin concentration(from bottom to top):from 0.010 μmol/L to 200 μmol/L)Supporting electrolyte:0.10 mol/L PBS(pH=5.5);accumulation time:600 s;scan rate:50 mV/s.

如表1所示，與其他蘆丁電化學(xué)傳感器相比，本研究構(gòu)建的傳感器具有較寬的線性范圍和低的檢測(cè)限。

表1 不同蘆丁電化學(xué)傳感器分析參數(shù)比較Table 1 Comparison of different electrochemical sensors for rutin analysis

2.5 電極的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和抗干擾能力

用相同的方法制備了6支修飾電極，分別檢測(cè)5.0 μmol/L蘆丁，得到響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.2%。同一支修飾電極對(duì)5.0 μmol/L蘆丁重復(fù)測(cè)定5次，RSD為5.4%。將電極在室溫下保存7 d后再測(cè)定蘆丁，響應(yīng)電流值為初始值的92.5%。說(shuō)明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。

在含有5 μmol/L蘆丁的PBS(pH=5.5)中，分別加入100倍的潛在干擾物，包括葡萄糖、蔗糖、多巴胺、抗壞血酸、槲皮素和柚皮素，考察它們對(duì)蘆丁電化學(xué)響應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)表明這些可能的干擾物對(duì)蘆丁的檢測(cè)影響較小，峰電流變化范圍為94.2%～107%。可見(jiàn)傳感器具有良好的選擇性。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

在上述優(yōu)化條件下，按“1.5”處理蕎麥茶和復(fù)方蘆丁片樣品并進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如表2所示，蕎麥茶試液中蘆丁的濃度為0.052 μmol/L，計(jì)算得蕎麥茶試樣中蘆丁的含量為0.158 mg/g；復(fù)方蘆丁片試液中蘆丁濃度為0.032 μmol/L，計(jì)算得復(fù)方蘆丁片中蘆丁的含量為0.165 mg/g。方法的加標(biāo)回收率為93.4%～102.3%，RSD為1.9%～4.6%。可見(jiàn)，該傳感器應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)有其良好的可行性。

表2 樣品中蘆丁的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of rutin in samples with the prepared sensor

3 結(jié)論

本研究通過(guò)將功能單體殼聚糖、模板分子蘆丁與離子液體功能化的石墨烯-碳納米管混合后，再用戊二醛交聯(lián)，可制備出具有良好導(dǎo)電性和多孔結(jié)構(gòu)的蘆丁分子印跡復(fù)合材料。將該復(fù)合材料滴加在玻碳電極表面制備的蘆丁分子印跡電化學(xué)傳感器，在優(yōu)化后的制備和測(cè)定條件下，表現(xiàn)出良好的分析性能。發(fā)展的方法不僅線性響應(yīng)范圍較寬、檢出限低，而且重現(xiàn)性好、選擇性和穩(wěn)定性較高，可以用于實(shí)際樣品中蘆丁的檢測(cè)。