微流控磁載酶級聯傳感器檢測唾液中葡萄糖的研究

夏 凌， 張麗松， 楊佳妮， 肖小華， 李攻科

(中山大學化學學院，廣東廣州 510275)

糖尿病是以高血糖為特征的全球性的公共健康問題，目前并無有效治療方法，主要通過對患者血糖水平進行持續、準確監測而加以控制[1]。常規的血糖監測方法依賴于血液的侵入性提取，如靜脈穿刺、手指穿刺等[2]。然而，采血過程是創傷性的，采集時會給患者帶來疼痛與不適，此外也存在潛在的交叉感染風險[3]。近年來，對尿液、汗液、唾液、淚液等體液中葡萄糖的非侵入性檢測的研究逐漸興起。唾液是由唾液腺分泌的生物液體，由多種物質跨細胞或亞細胞途徑從血液中滲透而成。相比于其他體液，唾液樣本易采集，組成相對簡單，干擾分析相對較小[4]，為監測人體激素、營養和代謝狀態提供了一種非侵入性血液分析途徑。已有研究表明，在健康受試者中，血糖含量和唾液葡萄糖含量間相關性較小，因為當血糖含量超過一定限度時，胰島β細胞將釋放胰島素進入血液，使血糖水平正常化[5]；而糖尿病患者唾液中葡萄糖含量明顯高于正常人，且與血糖含量成正相關關系。因此，檢測唾液中葡萄糖含量可作為有效的糖尿病篩查方法，也可作為糖尿病患者監測血糖含量變化的分析手段[6]。

人體唾液中葡萄糖含量極低，僅為血糖的1/100～1/50(3.6～36 mg/L)[7]，干擾組分也較血液更多，對分析方法的選擇性、靈敏度、樣品用量、響應時間等都提出更嚴苛的要求。基于酶催化反應的葡萄糖生物傳感器具有簡便、快速、選擇性好的特點，是檢測葡萄糖的常用方法。盡管酶的活性會受到反應條件的諸多限制，但因酶催化的高度選擇性和專一性，酶仍是最適當的葡萄糖傳感器生物識別元件[8]。而多酶參與的級聯催化，能將前一種酶催化形成的產物作為后續酶反應的底物，不僅減少中間產物的積累，還能利用多酶的協同作用提升整體酶反應的效率[9,10]。微型化、集成化、智能化是生物傳感器的發展的重要方向，而微流控芯片技術的引入正迎合了這種需求[11]。我們團隊已發展了一種集分離富集檢測于一體的微流控磁載免疫分析技術[12]，該技術能有效提高基于酶反應的免疫檢測靈敏度，有望應用于復雜樣品中痕量葡萄糖糖的酶催化傳感識別。

本文通過戊二醛交聯法在氨基化磁性微球上固定葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根過氧化物酶(HRP)，利用微流控磁載技術將磁性微球富集在微通道中，為GOx/HRP酶級聯反應提供限域環境，基于此構建了高靈敏熒光增強的葡萄糖傳感器，實現了唾液樣品中葡萄糖含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

倒置熒光顯微鏡(Axio Observer Z1，卡爾·蔡司股份公司)；注射泵(LSP10-1B，保定蘭格恒流泵有限公司)；臺式高速冷凍離心機(TGL-20M，湖南湘儀離心機儀器有限公司)；電動攪拌器(D2004W，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)。

Affimag PSC磁性微球(天津市倍思樂色譜技術開發中心)；戊二醛(50%，生工生物工程股份有限公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，Sigma-Aldrich)；牛血清白蛋白(BSA，≥98.0%，廣州賽國生物科技有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP，酶活：>300 U/mg，上海阿拉丁生化科技有限公司)；葡萄糖氧化酶(GOx，酶活：244 U/mg，北京索萊寶科技有限公司)；熒光探針Ampliflu Red(AR，≥98.0%，Sigma-Aldrich)；聚二甲基硅氧烷(PDMS，Midland-Michigan)；麥芽糖(生化試劑BR，國藥集團化學試劑有限公司)；葡萄糖、蔗糖(分析純，天津大茂化學試劑廠)；NaOH、KCl(分析純，廣州化學試劑廠)；果糖、抗壞血酸(99%，上海阿拉丁生化科技有限公司)；檸檬酸鈉(99.0%，天津市福晨化學試劑廠)。水為超純水。

1.2 GOx/HRP雙酶磁珠的制備

通過戊二醛交聯法在氨基化磁珠表面固定GOx和HRP，如圖1(A)所示。于1支10 mL離心管中，加入0.25 mL 5 mg/mL核殼型磁性微球懸浮液和3.5 mL 2.5%戊二醛溶液，混合均勻，封口，室溫搖晃3 h 后在磁鐵作用下進行磁性分離，移去上清液；用超純水洗滌三次，加入0.6 mL 5 mg/mL的GOx以及0.3 mL 10 mg/mL的HRP，混合均勻，封口，室溫搖晃12 h，使磁珠充分懸浮，保證酶均勻固定上去；磁性分離，移去上清液，用PBS充分洗滌除去未固定上的HRP和GOx后，加入1 mL 10 mg/mL BSA封閉表面可能未反應的醛基結合位點，混合均勻，封口，室溫搖晃3 h后磁性分離，移去上清液，加入1 mL PBS緩沖溶液，將反應得到的GOx/HRP雙酶磁珠(濃度為1.25 mg/mL)在4 ℃保存待用。

圖1 微流控磁載酶級聯反應葡萄糖檢測示意圖。(A)戊二醛交聯法制備GOx/HRP雙酶磁珠；(B)微流控磁載檢測步驟示意圖；(C)GOx/HRP酶級聯反應。Fig.1 Schematic of microfluidic magnetic enzyme cascade sensor delivery technique for glucose detection.(A) GOx-HRP bienzyme magnetic beads preparation via glutaraldehyde cross-linking method;(B) Operation of microfluidic magnetic enzyme cascade sensor delivery technique;(C) GOx/HRP enzyme cascade reaction.

1.3 微流控檢測芯片加工

用于葡萄糖檢測的微流控芯片是由PDMS通過軟光刻技術制作[13]。使用定制掩模版，在硅片上利用光刻膠構建微通道模板。采用最簡單的通道設計，通道尺寸為2 cm長、200 μm寬、40 μm深。通過PDMS澆注固化、脫模、打孔、等離子鍵合等步驟，構建PDMS-玻璃檢測芯片。

1.4 葡萄糖檢測步驟

檢測前，先在PDMS微通道上放置尺寸為30 mm×9.1 mm×2.7 mm的釹鐵硼磁鐵，如圖1(B)所示。再將GOx/HRP雙酶磁珠加入葡萄糖與酶底物AR的預混溶液，并置于進樣孔中。在注射泵抽取模式下，以16 μL/min的流速從進樣孔連續抽取10 μL樣品溶液灌注進微通道。當樣品溶液流經微通道時，磁珠被捕獲而富集在磁鐵下方。一旦進樣孔中所有樣品溶液都進入微通道，移除芯片和注射泵之間的連接管，并用膠帶密封住進樣孔和出樣孔。

完成進樣后，在室溫下進行雙酶級聯反應，如圖1(C)所示。通過倒置熒光顯微鏡監控芯片檢測區的熒光變化。通過CCD相機獲得熒光圖像，每2 min拍攝一次，并用ImageJ軟件對圖像灰度值進行分析。

1.5 唾液樣品制備

3名受試者用清水漱口3次，取其在空腹、無刺激狀態下自然分泌的唾液3～4 mL。采集的唾液經離心機在5 000 r/min下離心20 min，取上清液，于-20 ℃保存待用。

2 結果與討論

2.1 傳感機理與可行性分析

該微流控磁載酶級聯傳感器的傳感機理是在葡萄糖存在下通過兩步酶催化反應，氧化酶底物AR，生成強熒光發射的試鹵靈。為驗證GOx/HRP酶級聯反應在葡萄糖檢測中的可行性，雙酶磁珠和單酶磁珠混合物中，分別加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預混溶液，灌注進檢測芯片，并在外加磁場的作用下富集于在微流控通道的檢測區域，記錄微流控通道中不同酶反應時長的熒光信號強度。經過4、6、8、10、12和14 min的酶反應，GOx/HRP雙酶磁珠參與組具有較強的熒光信號，如圖2(A)所示；而HRP磁珠和GOx磁珠混合物參與組的熒光信號較弱，如圖2(B)所示。圖2(A)和2(B)磁鐵中心位置(dm=)的熒光信號強度與反應時間呈良好的線性關系，如圖2(C)所示。線性擬合方程的斜率可用于表征熒光信號產生的速率，即酶反應速率。由于GOx/HRP雙酶磁珠參與組、HRP磁珠和GOx磁珠混合物參與組的線性擬合方程的斜率分別為6.20和0.480，雙酶磁珠的酶反應速率為單酶磁珠混合物的12.92倍。磁珠上同時固定GOx和HRP時可促發酶級聯反應，在GOx催化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2的同時，HRP消耗H2O2并催化氧化酶底物AR生成熒光信號分子。酶級聯反應增大了酶的催化性能，使催化效率得到提高，縮短反應時間。

圖2 GOx/HRP雙酶磁珠參與組(A)與HRP磁珠和GOx磁珠混合物參與組(B)的不同酶反應時間的熒光照片，dm為微通道長度方向上距離磁鐵中心位置的距離，雙酶磁珠濃度為19.53 μg/mL，HRP磁珠和GOx磁珠濃度均為9.77 μg/mL。(C)磁鐵中心位置(dm=0)熒光強度與酶反應時間的定量關系。其中，曲線a為GOx/HRP雙酶磁珠參與組，線性擬合方程為y=6.20x-18.998(R2=0.9906)；曲線b為HRP磁珠和GOx磁珠混合物參與組，線性擬合方程為y=0.480x+4.737(R2=0.9545)。Fig.2 Fluorescence images of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads involved assays(A) and mixture of HRP labeled magnetic beads and GOx labeled magnetic beads involved assays(B) after different enzyme reaction periods.The dm refers to the distance measured from the middle of the magnet at length direction of microchannel.The concentration of bienzyme labeled magnetic beads,HRP labeled magnetic beads and HRP labeled magnetic beads were 19.53 μg/mL,9.77 μg/mL and 9.77 μg/mL,respectively.(C)The calibration curve describing the relationship between the fluorescence intensity at dm=0 and the reaction time.Line a represents the equations of linearity of y=6.20x-18.998(R2=0.9906) for GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads involved assays,while line b represents the equations of linearity of y=0.480x+4.737(R2=0.9545) for mixture of HRP labeled magnetic beads and GOx labeled magnetic beads involved assays.

在葡萄糖檢測過程中，微流控磁載技術不僅能將GOx/HRP雙酶磁珠輸送到微通道的檢測區域，還能通過外加磁場富集磁珠以增大酶在檢測區域的濃度。為評估磁富集對葡萄糖檢測性能的貢獻，不同濃度的GOx/HRP雙酶磁珠加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預混溶液，灌注進檢測芯片，在外加磁場和無磁場兩種情況下進行檢測，記錄微流控通道中不同酶反應時長的熒光信號強度。微流控磁載GOx/HRP酶級聯反應結果如圖3(A)所示，無外加磁場的結果如圖3(B)所示。熒光信號產生的速率(SI)與GOx/HRP雙酶磁珠濃度(cMBs)的關系如圖3(C)所示。與無磁場檢測相比，微流控磁載技術的磁富集可實現40倍的熒光信號放大。

圖3 (A)微流控磁載酶級聯反應不同時間檢測區的熒光信號，GOx/HRP雙酶磁珠濃度為0.49、0.98、1.95、3.91、7.81和15.6 μg/mL；(B)無磁場酶級聯反應不同時間檢測區的熒光信號，GOx/HRP雙酶磁珠濃度為15.6、31.3、62.5、125和250 μg/mL；(C)有磁場和無磁場環境下熒光信號產生的速率(SI)與GOx/HRP雙酶磁珠濃度(cMBs)的定量關系，誤差棒為3次平行實驗的標準偏差。其中，曲線a為磁富集組，線性擬合方程為SI=0.6242cMBs-0.0423(R2=0.9978)；曲線b為無磁場環境組，線性擬合方程為SI=0.0156cMBs-0.2515(R2=0.9960)。Fig.3 (A) Temporal variation in the measured fluorescence at the detection point for the microfluidic magnetic enzyme cascade reaction with samples containing different concentrations of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads:0.49,0.98,1.95,3.91,7.81 and 15.6 μg/mL;(B) Temporal variation in the measured fluorescence at the detection point for enzyme cascade reaction without magnetic field with samples containing different concentrations of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads:15.6,31.3,62.5,125 and 250 μg/mL;(C) The calibration curves describing the relationship between the fluorescence signal generation rate(SI) and the concentrations of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads(cMBs).The error bars represent the standard deviation of three measurements.Line a represents the equations of linearity of SI=0.6242cMBs-0.0423(R2=0.9978) for assays with magnetic preconcentration,while line b represents the equations of linearity of SI=0.0156cMBs-0.2515(R2=0.9960) for assays with magnetic field.

2.2 檢測靈敏度優化

在使用該微流控磁載酶級聯傳感器對葡萄糖進行定量分析前，先對各檢測靈敏度影響因素進行優化，包括磁珠粒徑、磁珠濃度和進樣流速。

2.2.1 磁珠粒徑為了考察磁珠粒徑對檢測靈敏度的影響，通過戊二醛交聯法分別在粒徑為0.5、4.5、6.5 μm的氨基化磁珠表面固定GOx和HRP，將GOx/HRP雙酶磁珠稀釋至12.5 μg/mL，然后加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預混溶液，灌注進檢測芯片，記錄微流控通道檢測區中熒光信號的產生速率。如圖4(A)所示，不同粒徑的GOx/HRP雙酶磁珠都能催化氧化酶底物AR生成熒光分子；而磁珠粒徑越小，熒光分子試鹵靈的生成速率越大。在交聯反應中磁珠用量相同時，磁珠粒徑越小，則比表面積越大，因此GOx和HRP在0.5 μm磁珠表面固定得多且充分。此外，磁珠粒徑越小，越易被磁富集于檢測區并參與酶催化反應。故，在所考察的3種粒徑磁珠中，0.5 μm的性能最優，后續實驗均使用粒徑為0.5 μm的GOx/HRP雙酶磁珠。

2.2.2 GOx/HRP雙酶磁珠濃度為了考察磁珠濃度對檢測靈敏度的影響，將濃度為0.61、1.22、2.44、4.88、9.77、19.53、39.06 μg/mL的GOx/HRP雙酶磁珠分別加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預混溶液，灌注進檢測芯片，記錄微流控通道檢測區中熒光信號的產生速率。如圖4(B)所示，當GOx/HRP雙酶磁珠濃度(cMBs)低于19.53 μg/mL時，熒光信號產生速率(SI)與cMBs成正比；當cMBs繼續增大時，SI無明顯增加。另一方面，高濃度磁珠灌注芯片容易引起微通道的堵塞，故選用19.53 μg/mL為最優磁珠濃度。

2.2.3 進樣流速進樣時，樣品溶液的流速會影響磁場捕獲磁珠的效果，所以考察了進樣流速對檢測靈敏度的影響。將19.53 μg/mL GOx/HRP雙酶磁珠加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預混溶液，灌注進檢測芯片，并通過注射泵控制進樣速度為8、12、16、32、64、128、256 μL/min，完成進樣后記錄微流控通道檢測區中熒光信號的產生速率。如圖4(C)所示，當進樣流速(Qinj)小于16 μL/min時SI變化不明顯；當Qinj大于16 μL/min時SI逐漸減小。所以后續實驗均選用16 μL/min為最優進樣流速。

圖4 檢測靈敏度優化。(A)磁珠粒徑；(B)GOx/HRP雙酶磁珠濃度；(C)進樣流速。誤差棒為3次平行實驗的標準偏差。Fig.4 Detection sensitivity optimization.(A) diameter of magnetic beads,dMBs;(B) concentration of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads,cMBs;(C) sample injection flow rate,Qinj.The error bars represent the standard deviation of three measurements.

2.3 標準曲線與檢出限

在最優實驗條件下，將GOx/HRP雙酶磁珠加入不同濃度葡萄糖與酶底物AR的預混溶液，分別灌注進檢測芯片，記錄微流控通道中不同酶反應時長的熒光信號強度，結果如圖5(A)所示。各種葡萄糖濃度下，熒光信號強度都與反應時間呈良好的線性關系。圖5(B)中熒光信號產生的速率(SI)隨著葡萄糖濃度的增大而增加，在0.01～100 μmol/L范圍呈良好的線性關系，線性回歸方程為：SI=0.0992cglucose+0.384，R2為0.9977，檢出限(S/N=3)為3.2 nmol/L。與文獻報道的其他方法[13 - 17]相比，微流控磁載酶級聯傳感方法樣品用量少、響應時間短、靈敏度高、線性響應范圍寬。

圖5 (A)微流控磁載酶級聯反應不同時間檢測區的熒光信號，葡萄糖濃度為0、0.01、0.1、1.0、10、25、50和100 μmol/L；(B)熒光信號產生的速率(SI)與葡萄糖濃度(cglucose)的校正曲線。誤差棒為3次平行實驗的標準偏差。Fig.5 (A) Temporal variation in the measured fluorescence at the detection point for the microfluidic magnetic enzyme cascade reaction with samples containing different concentrations of glucose:0,0.01,0.1,1.0,10,25,50 and 100 μmol/L;(B) The calibration curves describing the relationship between the fluorescence signal generation rate(SI) and the concentrations of glucose(cglucose).The error bars represent the standard deviation of three measurements.

2.4 特異性和重現性

實驗采用乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、KCl、NaCl、抗壞血酸、檸檬酸鈉作為干擾物質，評價微流控磁載酶級聯傳感方法的特異性。結果如圖6(A)所示，上述干擾物質濃度為10倍葡萄糖濃度時，所產生的響應信號很小，且在血液、唾液等實際樣品中，上述干擾物質的濃度要遠遠低于測試濃度10 mmol/L。因此在檢測實際樣品時，可忽略上述物質產生的干擾，即該傳感器對葡萄糖的檢測具有良好的特異性。另一方面，方法的重現性考察結果如圖6(B)所示。當葡萄糖濃度為10 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L時，檢測所得SI平均值分別為0.191、0.700、1.333，計算得相對標準偏差(RSD)分別為3.4%、3.1%、3.7%，表明該傳感器對葡萄糖檢測的重現性較好。

圖6 微流控磁載酶級聯傳感器的特異性(A)和重現性(B)。誤差棒為3次平行實驗的標準偏差。Fig.6 Selectivity(A) and reproducibility(B) of the proposed microfluidic magnetic enzyme cascade sensor.The error bars represent the standard deviation of three measurements.

2.5 唾液中葡萄糖濃度測定

利用所構建的微流控磁載酶級聯傳感器對唾液中葡萄糖濃度進行測定。采用標準加入法，在最優實驗條件下，將制備好的唾液樣品稀釋2倍后，與葡萄糖標準溶液和酶底物AR混合，加入GOx/HRP雙酶磁珠，灌注進檢測芯片，測定熒光信號產生的速率SI，計算得到人體唾液樣品中的葡萄糖濃度，如表1所示。測得3個唾液樣品中葡萄糖濃度為56.1、55.5和27.5 μmol/L，加標回收率為95.3%～103.1%，RSD小于4.5%，表明所構建的微流控磁載酶級聯傳感器對葡萄糖檢測的可靠性較高。

表1 人體唾液中葡萄糖濃度檢測結果Table 1 Determination results of glucose in human saliva

3 結論

本文通過戊二醛交聯法在氨基化磁性微球上固定了GOx和HRP用于酶級聯催化反應。所制備的GOx/HRP雙酶磁珠通過催化氧化葡萄糖產生檢測信號，該檢測信號可通過微流控磁載技術進一步放大。所構建的高靈敏熒光增強的葡萄糖傳感器樣品用量少、響應時間短、檢出限低、線性范圍寬、特異性高、重現性好，適用于人體唾液中葡萄糖含量的快速測定。