古DNA研究概覽

劉雅琳

DNA是絕大多數生物的遺傳信息載體，能從分子層面反映生物個體之間的差異。通過深度挖掘古代材料中的DNA信息，可以了解生物群體的歷史演變情況，也能探究生物類群之間的系統進化關系。但由于古DNA難以長久保存，內源DNA含量低（獲得的DNA絕大部分是外源的微生物DNA），且容易受到污染（主要指出土后現在生活人的接觸造成的污染），所以從化石中獲取屬于研究對象的內源古DNA并進行深入分析研究非常困難。但也存在極個別由于保存環境理想，樣本可能保留了微量內源DNA的情況，這些材料給研究古DNA提供了機會。隨著技術手段的不斷提高，科學家已能從這些保存良好的材料中獲取極微量的古DNA片段。再利用生物信息學技術，將高度破碎化的DNA片段信息進行拼接，從而獲得古代樣本中的遺傳信息，使我們能夠回溯到樣本生存的年代，以更廣闊的視角來分析人、動植物，甚至于微生物的遺傳歷史。

古DNA研究簡史

分子克隆技術、聚合酶鏈反應（PCR）技術相繼誕生之后，很快被引入古DNA研究中，許多學者試圖從博物館樣本、洞穴沉積物和永久凍土保存的古代動植物，以及古人類材料中獲取DNA。1984年，希古奇（R. Higuchi）等獲取了已滅絕動物斑驢的線粒體DNA序列片段，這是國際公認的古DNA研究開端[1]。然而，由于當時的技術和對古DNA特征認識的不足，早期研究中獲得的古DNA大多是來自外界的污染，且大部分結果不可重復。探索過程中，科學家逐漸積累了經驗，不斷改進實驗技術，為后來的研究發展奠定了基礎。

隨著研究的深入，科學家們開始意識到，對于高度降解的古DNA來說，規范的實驗標準十分重要，否則實驗結果將由于污染而不可重復。隨著古DNA提取方法的改進，以及研究標準的建立和完善，古DNA研究正式進入可重復的階段。這一階段研究的對象側重于含量相對豐富的線粒體DNA片段或者少量核基因序列。越來越多的實驗室開始進行相關方面的嘗試，推動了這一新興研究方向的快速發展。然而，由于PCR技術很難正確擴增含量極低的內源DNA片段，導致部分古DNA實驗結果仍然不可重復，所以針對人類的古DNA研究方法在該階段依舊受到極大的質疑[2]。

隨著二代測序技術的誕生，古DNA研究迎來了高速發展的時代。由于二代測序技術能夠得到極短的DNA片段信息（這與古DNA的特征相似），所以實驗人員可以進行測序，并通過生物信息技術進行拼接，來獲得可靠的古DNA數據。實驗方法也在這一階段不斷被革新，2010年拉斯馬森（M. Rasmussen）等報道了4000多年前的愛斯基摩人基因組[2]，格林（R. E.Green）等依據3個尼安德特人樣品繪制了尼安德特人的基因組草圖[2]。隨后，越來越多的古人類基因組被公布出來，如丹尼索瓦人、早期現代人（包括田園洞人、Ust’-Ishim和Oase 1）等[3]，研究也逐漸深入化和多元化。這些研究共同推動了古人類DNA研究不斷前進，為古人類遷徙路線及人群間基因交流的探索提供了遺傳學支持。

古DNA研究難點

獲取合適的材料是開展古DNA研究的第一個難點。古代材料由于距今年代久遠，絕大部分已經完全降解，保存良好的樣品十分稀少。例如，在中國南方溫暖潮濕的氣候條件下，很難發現保存良好的樣本。

其次，古樣本中內源DNA含量極低，獲取它們十分困難。內源DNA與環境中的微生物DNA混雜在一起，由于提取出的總DNA中，大部分是外源雜質DNA，內源DNA的比例非常低。即便是質量相對較好的樣品，也難以提取出足量的DNA，所以，有時候需要反復實驗才能得到足夠用于分析的DNA信息。研究人員需要在混雜的DNA中，將含量極少的內源DNA分離出來，并進行研究。例如，第一個尼安德特人基因組草圖是通過1%—5%的內源DNA重建的[4]。因此，科學家一直關注如何更好地將外源與內源DNA分離開來，如何降低外源雜質的影響等問題。

再次，古DNA還容易在獲取時遭受到出土后現在生活人的接觸造成的污染。任何形式的接觸都可能將操作人員的DNA帶入樣品中，進而對內源DNA造成污染。因此，古DNA的提取要在古DNA超凈實驗室中進行，實驗人員需全身防護。但即便是在超凈室內、防護設備齊全與操作規范的前提下，也不能完全避免實驗中的污染，所以這就要求研究人員在每一步都要建立空白對照，最終獲得數據進行相關的污染評估。

另外，DNA損傷也是古DNA研究面臨的關鍵問題之一。DNA損傷是一種正常的生命現象，時刻在生物體內發生，生物對其也有一套完善的修復機制，但是這種機制隨著生物的死亡而停止工作。DNA損傷程度與時間、溫度、酸堿度、濕度等因素有關，在寒冷干燥環境中保存的DNA損傷程度會小一些。生物死后的DNA損傷會導致DNA高度碎片化，且會帶來編碼錯誤，直接影響DNA測序的質量。

為了克服以上困難，研究人員提出了許多在實驗環節中的優化方案，比如在發掘和實驗過程中嚴格遵守操作流程，使用特殊的酶對古DNA片段進行損傷修復等。新的古DNA捕獲技術是其中一項關鍵技術，該技術大致分以下幾步：誘餌設計（能夠特異性識別古DNA的探針與磁珠相連形成誘餌）、總DNA獲取、文庫制備、雜交捕獲、雜質DNA片段清除、高通量測序[5]。我們利用這一技術，將4萬年前田園洞人的內源DNA含量，從捕獲前的不足0.03%提高到捕獲后的46.8%[6]。同時，新古DNA捕獲技術也可用于對內源DNA含量極低的樣本開展研究。除此以外，古DNA單鏈文庫的構建同樣是關鍵技術之一。采用新型的古DNA單鏈文庫技術，能夠獲取古樣品中單鏈DNA片段的信息，極大地提高古DNA片段的來源。針對古DNA特點開發的提取、文庫構建、古DNA捕獲和測序等技術，推動了古DNA研究的高速發展。

古DNA技術的重要意義

古DNA技術在諸多方面發揮了重要作用，已經幫助我們回答了以下問題：繪制了已滅絕的古老型人類（尼安德特人、丹尼索瓦人）基因草圖，并說明古老型人類與非洲以外現代人之間存在基因上的相互影響[3]；現代人祖先走出非洲并非只有一條遷徙路線[7]；中國南北方古人群早在9500年前已經分化，至少在8300年前，南北人群融合與文化交流的進程即已開始，4800年前出現強化趨勢，至今仍在延續[8]。

古DNA研究不僅能夠為我們回答以上人類基因交流和遷徙的問題，還在人類健康等方面具有重要意義。古人類基因貢獻對現代人在適應環境和健康方面產生影響：現代人基因組中含有大量源自尼安德特人的能影響角蛋白合成的基因，從而能較快地適應歐亞大陸較冷的環境；幫助藏族人適應極高海拔環境的EPAS1基因，很有可能與丹尼索瓦人有關[3]。除了對人類自身DNA研究外，對古人類牙結石中保留的微生物DNA的研究，也能從進化角度揭示了飲食變化對人類健康狀況造成的影響[9]。另外，古DNA研究已經成功應用于考古遺址出土沉積物中的生物古DNA信息的獲取，最近發表的有關白石崖溶洞遺址的沉積物DNA分析，為丹尼索瓦人在此長期生存的推斷提供了重要證據[10]。

結 語

隨著技術的發展，古DNA研究實現了從片段到基因組的突破。而針對那些古DNA特有的難題，科學家們又推出了一系列對策，如控制污染、建立文庫、基因捕獲、鑒別內源DNA等。

隨著古DNA技術的進一步發展，希望未來能夠從更大時間與空間尺度的樣本中獲取古DNA，如特別古老的樣本、炎熱環境中保存較差的樣本、外源污染多的樣本與各類環境沉積物樣本等。古DNA研究集中了考古學、遺傳學和生物信息學等多個研究領域的優勢，致力于各學科合作還原重大事件的源起，同時古DNA研究的發展也推動了各學科自身的進步。

[1]Higuchi R， Bowman B， Freiberger M， et al. DNA sequences from the quagga， an extinct member of the horse family. Nature， 1984， 312（5991）： 282-284.

[2]盛桂蓮， 賴旭龍， 袁俊霞， 等. 古DNA研究35年回顧與展望.中國科學：地球科學， 2016， 12： 14-28.

[3]張明， 付巧妹. 史前古人類之間的基因交流及對當今現代人的影響. 人類學學報， 2018， 37（2）： 206-218.

[4]Green R E， Krause J， Briggs A W， et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science， 2010， 328（5979）： 710-722.

[5]王恬怡， 趙東月， 張明， 等. 古DNA捕獲新技術與中國南方早期人群遺傳研究新格局. 人類學學報， 2020， 39（4）： 1-15.

[6]Fu Q， Meyer M， Gao X， et al. DNA analysis of an early modern human from Tianyuan Cave， China. Proc Natl Acad Sci USA， 2013， 110（6）： 2223-2227.

[7]Fu Q， Li H， Moorjani P， et al. Genome sequence of a 45，000-yearold modern human from western Siberia. Nature， 2014， 514（7523）： 445-449.

[8]Yang M A， Fan X， Sun B， et al. Ancient DNA indicates human population shifts and admixture in northern and southern China. Science， 2020， 369（6501）： 282-288.

[9]Adler C J， Dobney K， Weyrich L S， et al. Sequencing ancient calcified dental plaque shows changes in oral microbiota with dietary shifts of the Neolithic and Industrial revolutions. Nat Genet， 2013， 45（4）： 450-455.

[10]Zhang D， Xia H， Chen F， et al. Denisovan DNA in Late Pleistocene sediments from Baishiya Karst Cave on the Tibetan Plateau. Science， 2020， 370（6516）： 584-587.

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