應用無線溫度驗證系統實施發酵罐滅菌工藝驗證

李可維 張宏超 劉海晶 孫莉 張雪

摘要：根據發酵原料藥生產要求，對維生素C生產所用的發酵罐進行滅菌工藝驗證，通過熱分布測試確認發酵罐的溫度分布，通過微生物挑戰實驗確認發酵罐的無菌狀態。

關鍵詞：發酵罐 熱分布測試 微生物挑戰實驗

1 引言：

在維生素C發酵生產前需要保持確保空發酵罐的無菌狀態，依據制藥行業規范和GMP對發酵罐空消滅菌過程實施熱分布測試和微生物挑戰實驗。從而實現發酵過程的無菌純培養，降低發酵液染菌的風險，保證產品質量和生產效益。

2 GMP發酵罐的主要技術參數

（1）發酵罐工作體積為200m3。

（2）發酵罐由罐體，管路和控制系統組成。

（3）能夠準確控制攪拌速度、空氣流量和培養溫度，能夠精確測量溫度、pH值和空氣流量。

（4）發酵罐為上攪拌發酵罐，采用雙端面機械密封，具有良好的密封性能。

（5）無菌空氣采用雙級過濾器進行除菌過濾，過濾效率高，能夠耐受蒸汽滅菌。

（6）罐體和管路均采用304不銹鋼制作，接觸液體表面經過拋光處理，罐體具有零死角接種閥、取樣閥和底閥。

3 實驗儀器、耗材

3.1 WL-T1無線溫度驗證系統

型號 WL-T1通用型

感溫元件 PT1000

測量范圍 -60℃至150℃

精度 ±0.1℃

分辨率 0.01℃

記錄儀材質 316L不銹鋼

3.2生物指示劑

生產商：美國3M公司 型號：Attest 1262-S生物指示劑（蒸汽）

D值（121℃）：1.5～3.0分鐘 菌種：ATCC7953嗜熱脂肪地芽孢桿菌

培養溫度：56℃±2℃ 孢子量：1.0×106～9.9×106

Z值：≥6℃ 儲存條件：15～30℃，35%～65%RH

3.3可擴展試驗箱

設備型號：BXS-250 設備容積：250L

電源電壓：220V/50Hz 控溫范圍：0～70℃

出廠日期：2019年08月20日 出廠編號：190020

生產商：上海博迅實業有限公司醫療設備廠

3.4 高精度數字溫度計

設備型號：IPRT-1 出廠編號：19071829

量程：-200℃～500℃ 校驗周期：1年

校驗日期：2020年08月26日 下次校驗：2021年08月25日

生產商：深圳市研工科技有限公司

3.5 恒溫油槽

設備型號：CJTH-300A 設備出廠編號：8687

工作溫度范圍：90℃～300℃ 溫度波動度：±0.01℃

溫度均勻度：±0.01℃ 生產廠家：湖北唯立儀表廠

4驗證方案設計

4.1無線溫度驗證系統前校準

開機前檢查油槽內硅油液位是否在加熱管之上，檢查無誤連接電源。判斷標準處判定時間設置3分鐘，偏差要求值設置0.5℃。校準低點設置為110℃，高點設置為140℃，校驗點設置為125℃。設置后將無線記錄器和標準溫度計放置在恒溫油槽內。停止倒計時后，取出無線記錄器充分冷卻后擦干無線記錄器表面的水分，上傳無線記錄器的數據。完成校準過程。

校準結束后查看原始校準數據，查看溫度波動、補償值、偏差值是否有異常情況，在溫度校準報告的最后一頁查看校準是否通過。

4.2空消熱分布測試

（1）熱分布測試策略：

發酵罐是維生素C發酵設備，為確保持續穩定的微生物發酵需要，采用空消滅菌工藝，需進行熱分布測試。發酵罐在日常滅菌過程中，使用空消滅菌程序，在進行發酵罐驗證時將開展對應的滅菌程序測試和生物挑戰。基于生產工藝流程，發酵罐的空消滅菌工藝條件為（125℃/70min）。本次為該滅菌程序在該設備上的首次驗證，因此驗證方案設計為連續測試3次。

（2）熱分布測試風險分析

空消滅菌工藝本身的風險;溫度不能達到滅菌條件要求;溫度不均一（可能由于進汽程序、排汽/氣程序、設備結構造成的局部冷點）;滅菌時間不夠;空氣熱傳導和金屬熱傳導速度的差異造成滅菌時間的差異;

（3）熱分布布點風險控制策略：

根據滅菌對象的空間幾何形狀進行布點，以識別空間幾何形狀對溫度分布的影響;根據罐體內滅菌對象進行布點，以識別滅菌對象性質差異造成對溫度分布的影響;根據進汽點位置進行布點，以評估進汽點溫度（可能的高溫點）可能對滅菌效果影響;根據排汽點（疏水）進行布點，以評估排汽點溫度（可能的低溫點）可能對滅菌效果的影響;

布置15根溫度探頭，其中1#至12#探頭分別固定在發酵罐的上中下3層，按照罐體高度平均分為上中下三層，每層4個點，周邊每120度一個，1#、5#、9#為各層的中心點;

13#置于上封頭頂部空間中心位置;

14#置于罐底排放管道位置;

15#至放置在發酵罐溫度控制探頭處，

根據內壁部件選擇發酵罐的適當位置進行固定（盤管、擋板、攪拌器轉軸），如無適當依托則制作相應的內部托架;

（4）熱分布測試接受標準

在滅菌階段各點的累積F0值要求≥15為合格;

在滅菌階段，所有傳感器的溫度值均達到125℃;保壓時間達到70min。

（5）熱分布測試接受導出測試結果后，參照前校準對無線溫度驗證系統實施后校準。

4.3生物挑戰測試

（1）生物指示劑確認：選用嗜熱脂肪地芽孢桿菌ATCC7953;孢子量符合1.0×106～9.9×106cfu/條的標準

（2）生物指示劑放置要求：生物指示劑和無線溫度探頭同時進行布點。

（3）生物指示劑使用方法：

按照布點圖分別將生物指示劑放在發酵罐內不同位置，啟動滅菌程序進行滅菌。滅菌完畢，取出該生物指示劑。擠破內含的安瓿，與一支陽性對照管一起放于56℃培養箱內培養，48小時后觀察培養結果。

（4）生物挑戰測試可接受標準

陽性對照：培養后陽性對照指示管應有微生物生長，即培養基顏色呈黃色，則該次試驗有效。培養后陽性對照指示管標簽仍呈現粉紅色。

蒸汽滅菌后的生物指示劑：培養后經滅菌的所有生物指示劑保持紫色為無菌生長，判定為滅菌合格。培養后經滅菌的所有生物指示劑標簽從粉紅色變成棕色。

5 驗證結果分析

（1）無線溫度驗證系統校準結果分析

前校準及后校準均一次性通過，在校準溫度點無線探頭和標準溫度計的最大偏差為0.02℃，遠小于0.5℃的偏差要求，說明無線溫度驗證系統和恒溫油槽的穩定性較高，其穩定性和國外同類產品一致。

（2）熱分布結果分析

對三次熱分布測試的滅菌保持階段的最低溫度、滅菌保持階段的時間和累積的F0值進行統計。

2：熱分布測試關鍵數據匯總表

三次熱分布測試的滅菌段最低溫度均大于設定的滅菌可接受標準中的125℃，且三次熱分布測試滅菌段最低溫度極差為1.41℃。三次熱分布測試滅菌段最高溫度極差為0.63℃。三次熱分布測試的滅菌階段時間均為70min。最小累積F0值遠大于可接受標準15，且三次熱分布測試最小累積F0值極差為20.22。說明滅菌程序熱分布測試達到了預定目標，滅菌程序的重復性較好。

（3）微生物挑戰結果分析

所使用的生物指示劑信息：

生產商：3M 型號：1262-S 生產批號：333K3W

菌種：ATCC7953 孢子量：4.6×106CFU D值（121℃）：2.1min

存活時間：9.79min 殺滅時間：22.39min Z值：15℃

生產日期：2020年10月29日 有效期：2022年10月28日

每次滅菌測試結束后，罐體完成降溫后將生物指示劑與無線記錄儀一起取出，將指示劑中的培養基玻璃小瓶捏碎后，將生物指示劑放在生化培養箱中，在56℃的條件下培養48小時候觀察培養結果，三次滅菌的生物指示劑全部符合滅菌要求（呈深藍色），陽性呈現黃色，達到了滅菌驗證方案中的預定要求。

參照美國注射劑協會編寫的第61號技術報告《在線滅菌》中關于生物挑戰的分析，計算生物F0值如下：

FBIO=DT×SLR（孢子下降對數）

FBIO=DT×（logN0-logNF）

=2.1×（log4.6×106-log100）

=13.99

說明生物挑戰實驗已達到了過度殺滅（FBIO為12）的滅菌水平，滅菌條件能夠保證發酵罐的無菌條件下純培養要求。

6 結果討論

驗證實施前進行了多次的滅菌參數調試，以確保滅菌參數能夠符合滅菌工藝要求，在此強調良好的調試是滅菌驗證的成功的保證，沒有一個萬能的參數能夠滿足不同要求，一定要結合自身的實際情況去摸索符合自身實際情況的控制參數，也是基于此點本文并未列出非常具體的滅菌參數。本文的最大價值為制藥行業同仁提供一個可供參考的案例進行分享。

參考文獻

[1]《中國藥典2020年版》9207滅菌用生物指示劑指導原則

[2]GBT 19972-2018醫療保健產品滅菌 生物指示劑選擇、使用和結果判斷指南

[3]USP42-NF37 <1229.1> Steam Sterilization by Direct Contact

[4]Parenteral Drug Association Technical Report No.61 Steam In Place

作者簡介：李可維 1986.05.13 男 吉林省榆樹市 漢族 大學本科 助力工程師 從事藥品質量管理