河南人群親權鑒定中D12S391基因座突變分析

許玲利 張靜 杜祎銘 王若楠 鄭偉森

摘 要： 目的 對河南人群中D12S391基因座突變進行研究分析。方法 從河南事緣法醫物證司法鑒定所2018-2020年期間1000個親子鑒定案例中整理出家系進行分析，篩選存在等位基因突變案例，應用多重 PCR 擴增技術及毛細管電泳技術進行基因座分型，本DNA進行檢測分析。 結果 在 D12S391基因座2000次傳遞中共出現69次突變，均為1個位點突變，突變發生的概率男性要大于女性。 結論 準確獲得河南人群D12S391基因座的突變率，當出現疑似突變案例時應增加STR基因座的檢測數量，并且在計算存在突變案例的 CPI 值時，應考慮不同的人群和地域間、性別的差異，以最大限度地降低誤判風險。

關鍵詞：親權鑒定;D12S391基因座;突變分析;法醫遺傳學

河南人口眾多，隨著社會的高速發展，不同民族不同地域之間的聯姻逐漸增加，導致了人口遺傳信息分析的復雜性[1]。短串聯重復序列（Short Tandem Repeat，STR）是目前法醫物證中應用最廣泛的遺傳標記之一，具有高度多態性和遺傳穩定性[2]。在遺傳中也有可能發生基因突變的現象，因此，這給日常親權鑒定工作帶來了一定難度。 STR基因座突變，是等位基因從親代向子代遺傳過程中發生改變，表現為真實家系的STR基因座分型結果出現不符合遺傳規律的現象[3]。D12S391基因座位位于人類第12號，具有復雜的核心序列結構，群體遺傳學研究表明均具有高度的多態性，在法醫學同一認定及親子鑒定中具有較高的應用價值[4-5]。通過對實際案例中常染色STR 基因座突變情況的觀察與分析，可以對親子鑒定中突變問題的分析進行指導[6]，同時也能夠為日常親權鑒定工作及群體遺傳學研究提供基礎資料，幫助司法鑒定人在鑒定工作中更有效的判斷突變的發生及注意回避特殊案例中存在的風險。

1. 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自河南省事緣法醫物證司法鑒定所2018-2020年委托我所進行親權鑒定1000例。所有案例均為三聯體家系，肯定親權關系，并通過電話征求了當事人同意。每位當事人采集靜脈血0. 5 mL，用 EDTA抗凝，置于-20℃冰箱凍存。

1.2 儀器及試劑

EX22和21+1熒光檢測試劑盒（包括ReactionMix、Primers、Taq酶、Allelic Ladder、AGCU MarkerSIZ-500等）購自無錫中德美聯生物技術有限公司;GoldenEye_20A系統熒光標記檢測試劑盒（包括2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA聚合酶、PCR Grade Water、Orange-500等）購自江蘇蘇博醫學科技南京有限公司。GeneAmp 9700熱循環儀、3500型遺傳分析儀等均來自美國應用生物系統公司。

1.3 PCR擴增和電泳分型

用Chelex-100法提取基因組DNA。PCR擴增體系和程序嚴格按照試劑盒說明書操作。每次擴增以陽性對照DNA作陽性對照，用純水代替樣本DNA作陰性對照。用ABI3500 型分析儀進行毛細管電泳和熒光檢測，使用Gene Mapper v3.2 軟件分析基因型。

1.4 統計學與突變分析

根據試劑盒提供的STR基因座的基因頻率，當出現不符合遺傳定律的基因座時用 AGCU Express marker22 熒光檢測試劑盒驗證突變真實性，用AGCU 21+1 STR試劑盒（無錫中德美聯生物技術公司）補充STR位點，當補充位點均為符合情況時按照親權鑒定技術規范——司法部《親權鑒定技術規范》（GBT 37223—2018）和《法醫物證鑒定 Y-STR 檢驗規范》（SF， Z JD0105007—2018）計算親權指數（paternityindex， PI）、累積親權指數（cumulative paternityindex， CPI），μ為平均突變率0.002。當 CPI≥104時，則確認不符合遺傳定律的基因座為突變。

2. 結果

2.1常染色體D12S391基因座分型與頻率

1000 例河南漢族無關個體在D12S391基因座共檢測到16個等位基因。其中最常見的等位基因為 19（2135），最少見的等位基因有18.2、18.3、27。各等位基因及基因頻率，見表 1

2.2 D12S391基因座分型結果

親子鑒定案件運用GoldenEye_20A熒光系統檢測20個基因座分型結果是否符合遺傳規律。進一步采用EX22熒光檢測試劑盒檢測22個基因座進行復核驗證突變的STR位點，發現基因座的分型與上述結果一致，其余均符合遺傳規律（圖1）。采用AGCU 21+1試劑盒進一步檢測，共檢測 21個STR基因座，其中D19S433為重復基因座，新增的20個多態性STR基因座均符合遺傳規律。

2.3 D12S391基因座突變分析

根據人類遺傳規律，孩子的遺傳基因必然來自親生父母雙方。本案例D12S391基因座的突變來源于父親。在發現的69例突變中不同等位基因突變的概率見表2。

3. 討論

STR基因座突變與遺傳多態性程度有著一定的關系，對其發生突變機制的共識是DNA 復制滑動（replication slippage）[7]。表現為STR基因座等位基因重復單位的減少或增加，從而使新合成的DNA鏈減少或增加一至多個基序，對應則被稱為一步突變或多步突變[8-9]。擴增片段較大的STR基因座更容易發生突變，這可能是由于重復單位多的基因座其長度也較長，必然多態性程度也較高，其突變概率會隨之增加[10]。

司法鑒定技術規范要求累計親權指 數大于10000時支持被檢測男子（或被檢測女子）是孩子生物學父親（或母親），累計親權指數小于 0.0001支持被檢測男子（或被檢測女子）不是孩子生物學父親（或母親）[11]。所謂的突變均是建立于在認定親權關系的假設上。如果只有 1～2 個基因座不符合遺傳規律，累計親權指數在0.0001～10000之間應增加檢測其他高度多態性且遺傳穩定的STR基因座，以避免由于STR基因座突變導致錯誤地排除親權關系[12]。

STR 基因座突變存在性別差異，通常男性突變生概率高于女性[13]。本研究結果顯示，突變來源有明顯性別差異，父源突變與母源突變的比例為9：1，這與文獻報道一致[14]。本研究1000例案例中D12S391基因座突變有69例，均為1步突變。隨著二代測序技術的發展，在實驗室條件允許的情況下，還可以進行二代測序，新一代測序應用于法醫 DNA分析的有很大的優勢。它能夠分辨長度相同、但堿基序列不同的等位基因。通過檢測突變位點的堿基序列，從而判斷其變異的真實性。

因此，我們在進行親子鑒定時， 運用多種該技術手段進行驗證，提高準確率，并選用突變率低、多態信息含量相對較高的STR位點。在進行個體識別時，可選用突變率高的STR 位點如D12S391， 這樣會減少在分析結果時碰到困難的機會。

參考文獻

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河南省生殖健康科學技術研究院 河事緣法醫物證司法鑒定所 河南鄭州?450003