Relaxin協同BMP9誘導間充質干細胞成骨分化

趙辰 廖軍義 肖鵬程 黃偉

摘要：目的：探討BMP9與Relaxin在誘導間充質干細胞成骨分化過程中的協同作用。方法：以小鼠脂肪來源永生化間充質干細胞iMads作為誘導細胞，用采用腺病毒方式實現Relaxin與BMP9共表達，采用堿性磷酸酶，鈣鹽沉積實驗及PCR等方式觀察Relaxin對BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化的影響。結果：Relaxin增強BMP9誘導的堿性磷酸酶Alkaline phosphatase（ALP）活性的增加，獲取更多鈣鹽沉積。Realtime PCR提示成骨相關因子Runx2及Osx表達明顯增加，同時PPAR-γ表達也明顯下降，但并沒有促進骨橋蛋白的表達。結論：Relaxin可協同BMP9介導的間充質干細胞成骨分化。

關鍵詞：Relaxin ;BMP9;成骨誘導;

Objective： To investigate the synergistic effects of bone morphogenetic protein 9 （BMP9） and Relaxin on inducing osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.Methods： Immunized mouse adipocyte derived mesenchymal stem cells （IMADs） were used as seed cells. Adenovirus was used to co-express Relaxin and BMP9. The effects of Relaxin on osteogenic differentiation of BMP9-induced mesenchymal stem cells were investigated by alkaline phosphatase assay， calcium salt deposition assay and PCR in vitro and ectopic bone formation on null mice in vivo.Results： Relaxin enhanced the BMP9-induced ALP activity and resulted in increased calcium salt deposition. Realtime PCR test indicated that the expressions of osteogenic factors Runx2 and OSX were significantly increased but not OPN. Relaxin also enhance BMP9-induced ectopic bone formation with less adipogenic differentiation .Conclusion： Relaxin may collaborate with BMP9-mediated osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells

Keywords： Relaxin; BMP9; osteogenic induction;

背景：

骨缺損是當前臨床面臨的重要挑戰[1]。采用成骨誘導因子對干細胞進行誘導以獲取具有生理活性的生物工程骨是目前研究的熱點[2]。在 BMP家族（bone morphogenetic protein family）成員中，BMP9被證明具有最強的成骨誘導能力，在體內外均具有較強的成骨能力。研究表明BMP9可誘導多種來源的間充質干細胞成骨分化表達成骨因子 [3]。雖然BMP9具有較強的成骨能力，但在生物工程骨構建方面仍存在著誘導能力不足的問題。通過多分子組合獲取成骨最大化具有相當的現實意義。

Relaxin （Rln）是結構相關激素胰島素/Rln家族的成員，可通過激活 Rxfps膜受體發揮自分泌、內分泌和旁分泌作用。最近，Rln受體不僅在生殖組織中被發現，而且在骨骼組織包括成骨細胞、破骨細胞、骨細胞也存在表達，這提示Rln可能在骨生長發育中具有生理意義[4]。然而Relaxin在間充質干細胞分化為成骨細胞和體內骨形成的作用仍然未知。Moon等人在JMBR的研究發現BMP2所誘導的成骨作用可以被Relaxin表達增強，初步證明了Rln在間充質干細胞成骨分化中的作用[5]。

以上證據提示Relaxin可能參與BMPs誘導的間充質干細胞成骨分化。BMP9作為最強的BMPs成員，能否在Rln的協同下獲取更強的成骨能力，是一個頗具吸引力的課題。本研究通過腺病毒轉染方式在間充質干細胞內獲取BMP9與Relaxin高表達，以探究Relaxin對BMP9誘導成骨的協同作用。

1 材料與方法

1.2 主要試劑與材料

采用小鼠骨髓間充質干細胞株（C3H10T1/2）以及人胚腎293細胞株（HEK293），重組腺病毒Ad-BMP9、Ad-Relaxin，對照重組腺病毒Ad-GFP均由美國芝加哥大學分子腫瘤研究室主任何通川教授惠贈。胎牛血清（FBS）購自Bionid公司，而DMEM培養基和胰蛋白酶均購自HyClone公司，青鏈霉素等均購自上海碧云天生物技術有限公司。Real-time PCR引物皆由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 iMADs細胞的培養及誘導分化

iMADs細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的完全培養基在75 cm2細胞培養瓶中進行培養，分別加入適量Ad-GFP、Ad-BMP9、Ad-Relaxin、Ad-BMP9+Ad-Relaxin 病毒。感染之后的24小時后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.2堿性磷酸酶染色

堿性磷酸酶（ALP）測定使用改良的Great Escape SEAP化學發光法（BD Clontech）在腺病毒感染后5和7天評估早期成骨標志物ALP活性。

1.3.3鈣鹽沉積染色

將iMAD細胞接種于24孔板并感染腺病毒。感染細胞在抗壞血酸（50 mg/ml）和β-甘油磷酸鹽（10 mM）存在下培養。感染后第7天，使用茜素紅S染色法對礦化基質結節進行鈣沉淀染色.

1.3.4 Real-time PCR

按1.3.2的方法在6 孔板中培養iMADs 細胞，分別于第5天提取細胞總RNA，逆轉錄后行Real-time PCR，檢測，Runx2，OPN，PPAR-γ與Osx相對表達水平。GAPDH做內參，每次反應設3個平行復孔和無模板陽性對照（NTC），NTC未出現特異性擴增曲線。

1.4 統計學處理

計量資料以x±s表示，采用SPSS 19.0統計軟件進行隨機區組設計的方差分析，組間兩兩比較t檢驗。

結果：

2.1 重組病毒感染間充質干細胞后目的基因表達

感染24 h后，Ad-BMP9、Ad-Relaxin、Ad-BMP9+Ad-Relaxin及Ad-GFP感染C3H10T1/2的感染率達40%～50%，細胞生長狀態良好，未出現明顯凋亡征象 （圖 1），熒光檢查證明感染有效，BMP9與Relaxin可在目標細胞內穩定表達（圖1）。

2.2 Relaxin協同BMP9誘導MSCs體外成骨分化、

當iMADs細胞與AdBMP9/Rln共轉導時，第5天就顯著增強了BMP9誘導的早期成骨標志物堿性磷酸酶（ALP）活性， Rln共表達顯著增強了BMP9誘導的體外基質礦化，而Rln并不具有單獨誘導礦化的能力（圖2B）。

2.3 Relaxin協同BMP9誘導MSCs成骨分化時mRNA的表達變化

重組腺病毒感染iMADs后，提取第5天樣本中mRNA檢測發現在BMP9組與BMP9+Rln組中，成骨因子水平均明顯高于同時間點 GFP組（P<0.05）。高表達Rln促進了成骨早期Runx2和中期Osx mRNA的表達（P<0.05）。成脂分化標志因子 PPAR-γ的表達也明顯受抑制（圖3）。

討論：

BMPs家庭是備受關注的一類成骨誘導因子，BMP9證明具有強大的成骨能力。然而，BMP9介導的間充質干細胞成骨的效率仍離臨床要求存在較大距離，通過分子組合的方式獲得更佳的骨形成是目前的研究方向。

Rln，稱為妊娠激素，在妊娠期間起到了軟化宮頸的作用.Rln受體不僅在生殖組織中被發現，而且在骨骼組織包括成骨細胞、破骨細胞、骨細胞也發現了Rln受體的存在[6]。這提示RLN也可能在骨骼系統中具有重要作用。JMBR文章報道，鼠骨髓干細胞（BMSCS）在骨形態發生蛋白2誘導成骨細胞分化的作用可被BMP2顯著增強。Rln對于BMP9這一最強大的BMPs成員的作用仍不清楚。

通過Rln與BMP9共表達我們發現，Rln表達可顯著增強BMP9介導的成骨分化，提高了ALP活性的同時獲得了更高的鈣鹽沉積率。而通過Realtime PCR檢測我們發現，Relaxin顯著的上調了BMP9介導的Osx與Runx2表達，ALP染色提示堿性磷酸酶的表達也明顯加強。而相對的OPN的表達未見明顯的升高，這提示Rln可能通過早期增強成骨分化達到增強成骨的作用的。但值得注意的是，RLN本身不具備成骨誘導能力。同時Rln對成骨分化的調控具有階段性，其更可能在成骨分化早期起到促進成骨的作用。相對應的，我們發現PPAR-γ的表達在Rln表達下明顯受抑制，這提示Rln可能通過抑制BMP9介導的脂肪分化達到增強成骨的作用[7]。

綜上所述，本研究初步探明了Rln增強BMP9誘導成骨的作用，其作用可能通過上調Runx2與Osx等前中期成骨因子表達而抑制脂肪化標志因子的表達，提示Relaxin可能推動成骨早期分化，這提示Relaxin可能通過抑制脂肪化達到增強成骨作用。動物實驗進一步驗證了Rln對BMP9成骨的誘導作用。然而由于Rln依賴于多個受體進行調節，其作用機制的多樣性與復雜性，不同表達水平的Rln對在成骨分化中的作用尚待研究。

參考文獻：

1.Tatara AM， Mikos AG： Tissue Engineering in Orthopaedics. J Bone Joint Surg Am 2016;98：1132-1139

2. Bara JJ， Herrmann M， Evans CH， Miclau T， Ratcliffe A， Richards RG： Improving translation success of cellbased therapies in orthopaedics. J Orthop Res 2016;34：17-21

3. Lamplot JD， Qin J， Nan G， Wang J， Liu X， Yin L， Tomal J， Li R， Shui W， Zhang H， Kim SH， Zhang W， Zhang J， Kong Y， Denduluri S， Rogers MR， Pratt A， Haydon RC， Luu HH， Angeles J， Shi LL， He TC： BMP9 signaling in stem cell differentiation and osteogenesis. Am J Stem Cells 2013;2：1-21

4. Samuel CS， Lekgabe ED， Mookerjee I. The effects of relaxin on extracellular matrix remodeling in health and fibrotic disease. Adv Exp Med Bio. 2007;612：88–103. 37. Silvertown JD， Summerlee AJ， Klonisch T. Relaxin‐like peptides in cancer. Int J Cancer. 2003;107（4）：513–9.

5. Jung Sun Moon， SunHun Kim et al Relaxin Augments BMP2–Induced OsteoblastDifferentiation and Bone Formation. Journal of Bone and Mineral Research， Vol. 29， No. 7， July 2014， pp 1586–1596

6.Samuel CS， Lekgabe ED， Mookerjee I. The effects of relaxin onextracellular matrix remodeling in health and fibrotic disease. Adv Exp Med Bio. 2007;612：88–103.

7. Lamplot JD， Qin J， Nan G， Wang J， Liu X， Yin L， Tomal J， Li R， Shui W， Zhang H， Kim SH， Zhang W， Zhang J， KongY， Denduluri S， Rogers MR， Pratt A， Haydon RC， Luu HH， Angeles J， Shi LL， He TC： BMP9 signaling in stem cell differentiation and osteogenesis. Am J Stem Cells 2013;2：1-21

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