紅細胞膜納米載體的制備方法分析

白紅艷 劉妍 劉宜鑫 劉書偉 朱智

摘要：目的 觀察不同實驗條件對紅細胞膜納米載體制備效率和功能的影響，并探討制備紅細胞膜效率最佳時所需的低滲脹破時間。方法 取小鼠血液分離得到紅細胞（RBC），分別低滲脹破20 min、1 h、2 h，依次經離心、超聲和脂質體擠出等操作，制成紅細胞膜納米載體。通過透射電子顯微鏡（TEM）、ZS90納米粒徑電位分析儀完成形態表征，采用Western blotting法分析CD47膜蛋白，以及定量分析膜蛋白提取效率。結果 20 min、1 h、2 h三組不同時間下制備出的紅細胞膜納米載體形態規則，并成功保留發揮免疫逃逸作用的CD47蛋白，三組試驗蛋白定量分析結果分別為0.95、1.25、1.328 mg/ml。與20min組比較，1h、2h組蛋白定量水平均增高（P均<0.05），1h組蛋白定量指標增長最明顯（P<0.05）。結論 不同的實驗條件對紅細胞膜納米載體的形態結構及功能均無影響，可以影響膜蛋白提取效率。其中延長低滲脹破時間，蛋白定量結果增長緩慢，以1 h組制備效率最高。

關鍵詞：納米載體;紅細胞膜;仿生;制備

中圖分類號：R314 文獻標志碼：A

Abstract： Objective To elevate the effect of different experimental conditions on the efficiency and function of the preparation of erythrocyte membrane nanocapsules， and to investigate the time of hypotonic rupture when the efficiency of erythrocyte membrane is the best. Methods Red blood cells （RBC's） were isolated from the blood of mice， which were hypoosmotic and burst for 20 min， 1 h and 2 h， respectively. After centrifugation， ultrasound and liposome extrusion， the RBC membranes were made into nanocrystals. Morphology was characterized by transmission electron microscopy （TEM） and ZS90 nanoparticle potential analyzer， and CD47 membrane protein was analyzed by Western blotting method and the extraction efficiency of membrane protein was quantitatively analyzed. Results The morphology of the erythrocyte membrane nanocarriers prepared at different time of 20 min， 1 h and 2 h were regular， and the CD47 proteins that played the role of immune escape were successfully retained. The quantitative results of the three groups of proteins were 0.95， 1.25 and 1.328 mg/ mL， respectively. Compared with group 20 min， the quantitative levels of proteins were increased at 1h and 2h （both P<0.05）， and the most significant increase was observed at group 1h （P<0.05）. Conclusion Different experimental conditions have no effect on the morphology， structure and function of erythrocyte membrane nanocapsules and can affect the extraction efficiency of membrane protein. With the prolongation of the hypotonic burst time， the quantitative results of protein increase slowly. And group 1h has the highest preparation efficiency.

Key words： nano-carrier; erythrocyte membrane; bionic; preparation

針對微納米載體在體內運輸過程中所面臨的免疫清除難題，受自然細胞系統的啟發，研究人員引入紅細胞、巨噬細胞、細菌、血小板和干細胞[1-3]等天然細胞，分離出具有獨特生物學性能的細胞膜，以構建具有長循環特性、良好生物相容性的藥物傳遞系統。作為血液中數量最多且壽命最長的血細胞，紅細胞具有可塑變形性、滲透脆性、懸浮穩定性等特點，易于分離，是制備納米載體的良好材料。更值得一提的是，CD47作為紅細胞膜表面蛋白，可以發出“Don't eat me”信號，逃避體內巨噬細胞的監視和清除，這為紅細胞膜（RBCM）應用于納米載體提供了堅實的理論依據。紅細胞及紅細胞膜的來源與提取相對簡單，一般通過離心得到血液中的紅細胞，采用低滲溶血的方式獲取紅細胞膜[6];再通過擠壓、超聲、電脈沖等方法可以進一步獲得納米級別的紅細胞膜載體。然而制備紅細胞膜納米載體時，離心和低滲溶血的實驗條件難以標準化，存在很多差異，實際操作的復雜程度遠高于理論描述。2019年6月-2020年7月，我們觀察了不同實驗條件對紅細胞膜納米載體制備效率和功能的影響，并探討了制備紅細胞膜效率最佳時所需的低滲脹破時間。

1.材料與方法

1.1主要儀器與試劑

Sigma 3-30KS臺式高速冷凍離心機：德國SIGMA公司;Bioruptor非接觸式全自動超聲破碎儀（UCD-300）：比利時Diagenode公司;NanoDrop One/OneC UV-Vis：美國Thermo Fisher公司;ZS90納米粒徑電位分析儀：英國馬爾文儀器有限公司;-20℃冰箱：德國西門子股份公司;Milli-Q Reference超純水系統：美國Millipore 公司;Tanon VE-180垂直電泳槽、Tanon VE-180轉移電泳槽、Tanon EPS-300電泳儀、化學發光凝膠成像系統Tanon-5200Multi：上海天能科技有限公司;Orbital Shaker TS-2：海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Western洗膜盒：Biosharp公司。

肝素鈉（10mg/ml）：北京索萊寶科技有限公司;水合氯醛（10%）：國藥集團化學試劑有限公司;磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）：北京中杉金橋生物技術有限公司;凱基SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒：江蘇凱基生物技術股份有限公司;PageRuler PrestainedTM Protein Ladder：美國Thermo Fisher公司;SDS-PAGE電泳液、Western轉膜液、Western封閉液、RIPA裂解液（中）：Beyotime 公司;Anti-CD47 mouse monoclonal antibody：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG（H+L）：杭州昕誠生物科技有限公司5*DualColor Protein Loading Buffer、Tris緩沖鹽溶液、硝酸纖維素（NC）膜：微科曼得生物工程有限公司;通用型抗體稀釋液、超敏ECL化學發光試劑盒：新賽美生物科技有限公司。

1.2 實驗條件的篩選

在查閱文獻了解關于紅細胞膜納米載體制備方法時，我們發現實驗過程的關鍵條件[7-12]往往描述不一，如低滲脹破時間、轉速及低滲介質溫度等（表1）;另外，研究人員在參考文獻時也會綜合實際情況適時調整實驗條件[11.12]。

針對上述問題，我們認為要獲取純凈、豐富、穩定、有應用價值的紅細胞膜納米載體，尚需對提取RBCM過程中的系列條件進行優化，如裂解紅細胞膜所需的介質溫度、低滲脹破時間、離心轉速等。

我們分析明確了各項實驗條件以及其實施意義。離心力與轉速的換算關系如下：G=1.11×10（-5）×R×（rpm）2 ，其中，G為離心力，一般以g（重力加速度）的倍數來表示，R表示半徑，rpm表示轉速。可見離心力與轉速、半徑成正比關系。據了解，醫院檢驗科分離血漿采用的轉速標準是3000 rpm，離心機轉頭平均半徑在6 cm左右，此時的離心力約等于600*g，在此轉速標準下的離心力已可以較好的滿足分離血漿的需求。由此說明，800*g的離心力和3000 rpm的轉速均可以達到較好分離血漿的目的，兩者均可以選擇。

除了選定分離血漿的轉速，我們還分析確定了RBCM低滲脹破所需的介質溫度及分離紅細胞膜與血紅蛋白的臨界轉速。有關資料顯示，為保障血液成分的有效性，不同血液成分保存條件不同，懸浮紅細胞4℃冷藏保存[13]為最佳。低滲過程提取RBCM時，為了維持紅細胞膜性能，將低滲脹破的實驗溫度控制在4℃;紅細胞經過低滲脹破，釋放血紅蛋白，得到紅細胞膜。分離出細胞膜需要在較大的離心力下才可以實現RBCM沉淀，數次實驗發現14000 rpm的轉速下得到粉紅色RBCM沉淀，此時將沉淀溶解后在13000 rpm下再次離心，沉淀顏色即呈淡黃色。因此，14000 rpm下的離心力較大，易將質量較小的血紅蛋白與RBCM一并沉淀，而13000 rpm的離心力則可以得到較為純凈的不含血紅蛋白的RBCM。

關于低滲脹破時間對RBCM提取效率的影響，鑒于紅細胞具有的滲透脆性，在固定濃度的低滲鹽溶液中，隨著時間延長，溶液的濃度會因紅細胞破裂釋放的血紅蛋白而逐漸上升，溶液的脹破效果也逐漸降低，明顯低于初始的低滲鹽溶液。故決定通過分組實驗討論脹破時間可能對RBCM提取效率產生的影響。

因此，本實驗選用雄性KM小鼠（6-8周）9只，定量心臟取血0.8 mL，在等滲離心3000 rpm，6 min，低滲離心13000 rpm，10 min，介質溫度4℃等基礎條件下，分組實驗以探討不同的低滲脹破時間對RBCM功能和提取效率的影響。實驗過程中，為確保紅細胞膜納米載體制備成功，對紅細胞膜納米載體進行形態結構、電位等表征測定，并通過 Western blotting實驗證實發揮RBCM功能的關鍵蛋白CD47是否存在。最后應用定量分析來比較不同低滲脹破時間下得到的RBCM蛋白量，以反映膜提取效率的高低。

1.3 RBCM收集與處理

取正常雄性KM小鼠（6-8w）心臟血液0.8 mL以獲取RBCs，將采集的血液樣品置于裝有抗凝劑的試管中并編號。所取血液以3000 rpm，4℃離心6 min后，去除上清液，得到紅細胞沉淀。隨后以1：4的體積比用磷酸鹽緩沖液（1×PBS，pH=7.3，4℃）沖洗，離心（3000 rpm，4℃，6 min）棄上清液，重復此提純紅細胞步驟三次。將得到的RBCs懸浮于0.25×PBS溶液（4℃）中誘導細胞膜破裂。然后在13000 rpm，4℃離心10 min，去掉上清液。重復離心步驟，直至上清液透明，沉淀為淡黃色。

將得到的RBCM沉淀溶在1×PBS溶液中，采用超聲破碎儀對其進行超聲處理。超聲后的RBCM通過擠壓方法獲得紅細胞膜納米載體，用于后續的定量、定性分析。

1.4 紅細胞膜納米載體表征

分別將紅細胞膜納米載體通過透射電子顯微鏡（TEM）、ZS90納米粒徑電位分析儀進行形態、水合粒徑（DLS）、Zeta電位測定。

1.5 Western blottingting分析CD47膜蛋白

樣品處理上樣后，100V電泳，待樣品泳至濃縮膠和分離膠的分界處，調整電壓為120V，電泳樣品至凝膠末端即終止電泳，進行轉膜。在轉膜模具中依次放置NC膜、凝膠等材料，驅除氣泡后閉合模具進行轉膜。完成轉膜后利用封閉液室溫封閉2h，將封閉后的轉印膜依次分別與一抗（CD47蛋白抗體）、二抗（山羊抗鼠抗體）進行免疫反應，特異性抗體可對凝膠電泳處理過的細胞膜進行著色，通過底物化學發光ECL，在化學發光凝膠成像系統中可分析NC膜著色的位置和著色深度，即獲得特定蛋白質（CD47蛋白）的相關信息。

1.6 紅細胞膜納米載體膜蛋白定量測定

由于蛋白質中含有酪氨酸和色氨酸殘基，因此蛋白質溶液在280 nm處具有特征性的紫外吸收峰。根據朗伯-比爾定律，一定濃度范圍內，蛋白質溶液在280nm波長處的吸光度與其濃度呈正比，所以測定蛋白質溶液280 nm處的吸光值獲得蛋白含量，可完成紅細胞膜提取效率的測定。

1.7 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P < 0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1紅細胞膜納米載體表征測定

紅細胞膜納米載體的TEM圖片如圖A、B、C所示，20 min、1 h、2 h三組不同低滲脹破時間下的納米載體呈規則、完整球形狀，粒徑在120 nm左右。圖D、E顯示紅細胞膜依次經過超聲破碎儀、脂質體擠出器處理后的直徑大小。Zeta電位為-10 mV左右（圖F）。

2.2 紅細胞膜納米載體膜蛋白電泳分析

上圖所示三組不同條件下制備的紅細胞膜納米載體的Western blotting結果，蛋白條帶的存在證實紅細胞納米載體成功保留了紅細胞的表面膜蛋白CD47。

2.3 紅細胞膜納米載體膜蛋白定量結果分析

與20min組比較，1h組和2h組紅細胞膜納米載體蛋白定量水平均增高，且2h組高于1h組（P<0.05）。

3.討論

納米細胞膜涂層技術突破了普通納米載體系統在循環中快速消除的局限性，可被用于藥物載體、靶向成像、診療一體化等方面。以紅細胞膜修飾的納米載體具有長循環、可降解的優點，在納米載藥仿生系統中得到了廣泛關注。目前，雖然關于紅細胞膜納米載體的研究眾多，但研究中使用的紅細胞膜均來自于天然紅細胞，且制備方法描述不一，存在差異，這就使得利用紅細胞膜作為納米載體的各項研究開展受到材料來源困難的限制，不能有效開展大規模制備及研究應用。因此，明確紅細胞膜納米載體制備的實驗條件是亟待解決的問題。

紅細胞膜納米載體在完成表征測定和 Western blotting實驗后，證實其粒徑、Zeta電位均與Min Gao [14]構建的PFC@PLGA-RBCM性質相近，且CD47蛋白也被成功保留，由此確定已得到形態表征和性能均符合要求的納米載體。這表明經過上述實驗條件可以實現理想紅細胞膜納米載體的制備，不同的低滲脹破時間不會影響紅細胞膜的形態結構和表面電位等物理性能，但會影響膜提取效率。

在評估上述不同低滲時間的脹破效能時，采用方差分析，P<0.05可以認為不同時間下的RBCM濃度存在差異。表2中列出的數值顯示，經過脂質體擠出器操作后，膜蛋白數量減少，這是由于擠壓膜不可避免的會吸附囊泡，使膜蛋白有一定損失。由表2可知，1h組和20min組相比，脹破時間延長40min，膜提取效率增加31.6%。與20min組、1h組相比，2h組時間分別延長100 min及60 min，而膜提取效率增加39.8%、6.2%。由此可見，隨著時間延長，膜蛋白數量的增長幅度逐漸降低，1h組同時平衡了膜蛋白數量和脹破時間，是較為理想的高效率組別。所以，在制備紅細胞膜納米載體實驗中，建議根據需求選擇較為合適的低滲脹破時間。若研究過程中所需紅細胞膜數量較多，建議選擇1h低滲脹破處理以提高試驗效率。

隨著對細胞膜納米載體研究的深入，發現盡管細胞膜穩定性不如人工合成的納米材料，體內安全性也待進一步探索和研究，但其長循環特性、可降解性及免疫耐受性使其相比于人工合成材料仍具有廣闊的應用前景。目前已有相關研究表明，紅細胞膜納米載體除輸送藥物外，用途廣泛。如Min Gao [14]構建PFC@PLGA-RBCM作為長循環氧載體，改變了腫瘤乏氧環境，可協助膠質瘤的放療;張良方團隊構建RBC-血小板復合膜，不僅進一步增強了納米顆粒的功能，同時還保留了兩種來源細胞的特性，如長半衰期與免疫耐受性，特別是血小板的癌癥靶向性[15]。因此，我們相信利用紅細胞膜作為納米載體的研究具有巨大研究價值。但仍需要注意的是，生物膜的生物安全性和天然活性對納米載體功能至關重要，操作過程中需避免引入污染物（如熱原、病毒等），并防止膜蛋白的變性。

綜上所述，在控制等滲離心條件為3000rpm、6min，低滲離心條件為13000rpm、10min，并保持實驗中介質溫度為4℃時，紅細胞膜納米載體保留了原有的特征性膜蛋白CD47，粒徑可達到100-200nm。在此基礎上，選擇1h的低滲脹破時間可在較短時間內獲得高質量的紅細胞膜納米載體，進一步提高納米載體的提取效率，為紅細胞膜納米載體的深入研究提供豐富的原材料。

參考文獻：

[1] Hu CM， Zhang L， Aryal S， et al .Erythrocyte membrane-camouflflaged polymeric nanoparticles as a biomimetic delivery platform. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108：10980–5.

[2] Xuan M， Shao J， Dai L， et al. Macrophage cell membrane camouflflaged mesoporous silica nanocapsules for in vivo cancer therapy. Adv Healthc Mater 2015;4：1645–52.

[3] GAO W，FANG R H，THAMPHIWATANA S，et al. Modulating antibacterial immunity via bacterial membrane-coated nanoparticles[J].Nano Letters，2015，15（ 2） ： 1403-1409.

[4] Hu Q， Sun W， Qian C， et al. Anticancer platelet-mimicking nanovehicles. Adv Mater 2015;27：7043–50.

[5] GAO C，LIN Z，JURADO-SNCHEZ B，et al. Stem cell membrane-coated nanogels for highly efficient in vivo tumor targeted drug delivery[J].Small，2016，12（ 30） ： 4056-4062.

[6] Doshi N，Zahr AS，Bhaskar S et al. Red blood cell-mimicking synthetic?Biomaterial Particles[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（51）：21 495.

Zhilan Chai， Xuefeng Hu， Xiaoli Wei et al.A facile approach to functionalizing cell membrane-coated nanoparticles with neurotoxin-derived peptide for brain-targeted drug delivery[J].Control Release. 2017，264：102-111.

[7]Zhu DM ， Xie W， Xiao YS， et al.Erythrocyte membrane-coated gold nanocages for targeted photothermal and chemical cancer therapy [J].Nanotechnology.2018，29（8）：084002.

[8]Ren H ， Liu J ， Li Y ，Oxygen self-enriched nanoparticles functionalized with Erythrocyte membranes for long circulation and enhanced phototherapy[J].Acta Biomater. 2017;59：269-282.

[9]董曉婷，納米紅細胞膜負載丹參酮IIA磺酸鈉釋藥系統的構建及其特性評價[D].廣東：廣東藥學院，2018.

[10]Gao M ， Liang C ， Song X ，Erythrocyte-Membrane-Enveloped Perfluorocarbon As Nanoscale Artificial RedBlood Cells to Relieve Tumor Hypoxia and Enhance Cancer Radiotherapy[J].Adv Mater. 2017 ;29（35）.

[11]X. Ren， R. Zheng， X. Fang， X. etal.Red blood cell membrane camouflflaged magnetic nanoclusters for imaging-guided photothermal therapy[J].Biomaterials 92 （2016） 13–24.

[12]Sun L ， Li Q ， Hou M ， et al.Light-activatable Chlorin e6 （Ce6）-imbedded erythrocyte membrane vesicles camouflflaged Prussian blue nanoparticles for synergistic photothermal and photodynamic therapies of cancer[J].Biomater Sci. 2018，6（11）：2881-2895.

[13]血液儲存要求，中華人民共和國衛生行業標準，WS 399-2012.

[14]Min Gao， Chao Liang， Xuejiao Song， et al.Erythrocyte-Membrane-Enveloped Perfluorocarbon as Nanoscale Artificial Red Blood Cells to Relieve Tumor Hypoxia and Enhance Cancer Radiotherapy[J].Advanced Materials，29 （35）

[15]Diana Dehaini， Xiaoli Wei， Ronnie H. Fang， et al.Erythrocyte–Platelet Hybrid Membrane Coating for Enhanced Nanoparticle Functionalization[J].Advanced Materials. 2017 Apr;29（16）.

第一作者簡介：白紅艷（1998-），女，本科生，主要研究方向為醫學影像學。E-mail：1461750847@qq.com

劉妍（1997-），女，本科生，研究方向為醫學影像學。E-mail：2330198849@qq.com

徐州醫科大學醫學影像學院 江蘇徐州 221004