核桃低聚肽對急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的改善作用

張亭 劉睿 珠娜 郝云濤 康家偉 胡佳妮 毛瑞雪 劉欣然 李勇

摘?要：目的：探討核桃低聚肽（WOPs）對急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的改善作用。方法：成年雄性BALB/C小鼠按體重隨機分為6組，空白對照組、模型對照組和3個WOPs劑量組（220、440、880 mg/kg BW），每組10只。小鼠飲用5%DSS構(gòu)建急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，灌胃給予相應(yīng)受試物7 d，每日觀察測量DAI。7 d后，處死小鼠測量結(jié)腸外觀形態(tài)及長度變化、CMDI，血清DAO、D-LA含量，結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MPO含量，并進行結(jié)腸組織病理學(xué)觀察。結(jié)果：WOPs能顯著減少血清DAO和D-LA含量，降低DAI評分、結(jié)腸組織MPO、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，提高IL-10水平，明顯增加結(jié)腸長度，降低CMDI。此外，WOPs還可以恢復(fù)DSS所致的結(jié)腸黏膜炎癥損傷。結(jié)論：WOPs對經(jīng)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠具有改善作用，其機制可能與調(diào)整機體內(nèi)促炎因子與抗炎因子含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞：核桃低聚肽;急性潰瘍性結(jié)腸炎;小鼠

目前臨床藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎均存在一定的不良反應(yīng)，因此，尋找天然安全有效的化學(xué)物治療急性潰瘍性結(jié)腸炎顯得尤為重要。我國核桃資源非常富足，研究表明，核桃在改善學(xué)習(xí)記憶[1]、預(yù)防心腦血管疾病[2]、糖尿病[3]、調(diào)節(jié)體重[4]、抗癌[5]等方面均具有一定的作用。低聚肽是氨基酸的低聚物，在體內(nèi)可不經(jīng)消化直接吸收，能夠明顯降低腸道消化以及廢物排出負擔(dān)[6]。本研究采用DSS構(gòu)建急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，通過疾病活動指數(shù)（DAI）、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）、病理變化、血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)以及結(jié)腸組織炎癥因子等含量的測定，探討核桃低聚肽（WOPs）對急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的改善作用。

1?材料與方法

1.1?實驗動物

健康SPF級成年雄性BALB/c小鼠，體重18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0010;使用許可證號：SYXK（京）2016-0041。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食、飲水。動物飼養(yǎng)實驗室溫度為（25±1）℃，相對濕度為50%～60%，晝夜周期節(jié)律控制在12 h/12 h。

1.2?主要試劑與儀器

WOPs，北京天肽生物科技有限公司;葡聚糖硫酸鈉（DSS）、糞便潛血試劑盒，北京愛特蒙科技有限公司;DAO、D-LA、MPO、TNF-α、IL-6、IL-10等ELASA試劑盒，北京泰格諾克科技有限公司。

1.3?分組與處理

小鼠按體重隨機分為6組，空白對照組、模型對照組和3個WOPs劑量組（220、440、880 mg/kg BW），每組10只。小鼠自由飲用5%DSS 7 d，每隔1 d更換新鮮的DSS溶液。空白對照組用飲用蒸餾水。造模第1天開始灌胃給藥，除空白對照組與模型對照組給予蒸餾水外，其余各組以0.1 mL/10 g體重給予相應(yīng)受試物7 d。

1.4?指標(biāo)

1.4.1?DAI評分?每日稱量小鼠體重，觀察大便性狀和便血情況，并按以下評分標(biāo)準(zhǔn)[7]進行評分，將體重下降、大便性狀和便血情況評分均值作為DAI（表1）。大便潛血按照糞便潛血試劑盒使用說明操作。

1.4.2?結(jié)腸外觀形態(tài)及長度變化?迅速剖開腹腔，游離結(jié)腸和遠端回腸，取出肛門至盲腸末端整個腸段，觀察各組結(jié)腸外觀形態(tài)改變、測量肛門至盲腸末端的整個腸段長度。

1.4.3?結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評分?沿腸系膜剪開結(jié)腸，用預(yù)冷無菌生理鹽水漂洗干凈結(jié)腸，清除結(jié)腸黏膜表面黏附的糞便、分泌物及血液。將結(jié)腸平鋪于冰盒上，肉眼觀察，CMDI評分參照Luketal標(biāo)準(zhǔn)進行[8]：0分為結(jié)腸無損傷;1分為結(jié)腸輕度水腫但沒有潰瘍;2分為充血且腸黏膜粗糙呈顆粒狀;3分為結(jié)腸黏膜潰瘍形成，直徑約0～1 cm;4分為結(jié)腸黏膜潰瘍形成，直徑約1～2 cm，但腸管與外周臟器無粘連;5分為潰瘍直徑1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴重。

1.4.4?血清D-LA及DAO的檢測?血清D-LA及DAO含量測定按照ELISA試劑盒的操作說明進行，每個樣品設(shè)定2個復(fù)孔，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品含量，結(jié)果取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.4.5?結(jié)腸組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及MPO的檢測?結(jié)腸炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MPO含量測定方法按照ELISA試劑盒中操作說明進行。

1.4.6?結(jié)腸組織病理學(xué)觀察?在結(jié)腸遠端炎癥反應(yīng)明顯處取長約2 cm的結(jié)腸組織置于10%福爾馬林浸泡固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5?統(tǒng)計方法

實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，小鼠血清DAO、D-LA含量及結(jié)腸炎癥因子采用單因素方差分析;其他數(shù)據(jù)方差齊采用單因素方差分析，方差不齊者采用非參數(shù)檢驗。實驗組與對照組兩兩組間比較采用最小顯著差異法，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2?結(jié)果與分析

2.1?WOPs對DSS誘導(dǎo)小鼠DAI評分的影響

從表2可以看出，模型組小鼠DAI評分明顯升高（P<0.01），表明經(jīng)DSS誘導(dǎo)的小鼠體重、腸道均受到不同程度的影響。與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠DAI評分明顯降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）。

2.2?WOPs對DSS誘導(dǎo)小鼠D-LA和DAO的影響

如表3所示，模型對照組小鼠血清D-LA和DAO含量較空白對照組顯著增加（P<0.01、P<0.01），表明經(jīng)DSS誘導(dǎo)后，腸道黏膜上皮細胞出現(xiàn)不同程度損傷，腸道黏膜通透性增加。與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠血清D-LA含量均明顯降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）;WOPs各劑量組小鼠血清DAO含量均有所降低，其中WOPs中、高劑量組降低明顯（P<0.05、P<0.01）。

2.3?WOPs對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的影響

如表4所示，模型對照組結(jié)腸組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量較空白對照組均顯著增加（P<0.01、P<0.01、P<0.01），IL-10含量明顯減少（P<0.01）。與模型對照組相比，WOPs各劑量組結(jié)腸組織IL-1β、IL-6均顯著降低（P<0.01、P<0.01），IL-10含量顯著增加（P<0.01）;各組TNF-α水平均有所下降，其中WOPs高劑量組下降明顯（P<0.05）。

2.4?WOPs對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸MPO的影響

如表5所示，模型對照組小鼠結(jié)腸組織MPO含量較空白對照組顯著增加（P<0.01），表明經(jīng)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中性粒細胞浸潤的數(shù)量增多，程度加深。與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠血清MPO含量均有所降低，其中WOPs中、高劑量組降低較為顯著（P<0.05、P<0.01）。

2.5?WOPs對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸外觀、形態(tài)和長度的影響

模型組小鼠結(jié)腸充血、水腫嚴重，呈現(xiàn)暗紅色。WOPs各劑量組上述現(xiàn)象緩解。如表6所示，模型對照組小鼠結(jié)腸長度較空白對照組明顯降低。與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠結(jié)腸長度均顯著增加（P<0.01、P<0.01、P<0.01）。

2.6?WOPs對DSS誘導(dǎo)小鼠CMDI的影響

如表7所示，模型對照組CMDI明顯高于空白對照組（P<0.01）。與模型對照組相比，WOPs高劑量組小鼠CMDI明顯降低（P<0.01）。

2.7?WOPs對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸黏膜病理的影響

附圖為結(jié)腸組織病理切片HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果。空白對照組中，基本無炎性細胞浸潤（附圖a）。與空白對照組相比，模型對照組鏡下出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞和淋巴細胞為主。結(jié)腸炎癥破壞腸壁，嚴重者侵犯至漿膜層。此外，該組結(jié)腸組織出現(xiàn)杯狀細胞的缺失（附圖b）。與模型對照組相比，WOPs低劑量組仍有部分炎性細胞浸潤，但均已局限在黏膜層（附圖c）。WOPs中、高劑量組結(jié)腸組織炎性細胞浸潤減少明顯，且隨著WOPs劑量的增加，結(jié)腸杯狀細胞逐漸變?yōu)檎＃ǜ綀Dd、e），表明WOPs能夠改善結(jié)腸炎癥細胞浸潤所致的組織損傷，具有一定的恢復(fù)作用。

3?結(jié)論

綜上所述，WOPs對急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠具有明顯的改善作用，其機制可能與調(diào)節(jié)小鼠結(jié)腸內(nèi)抗炎因子與促炎因子平衡有關(guān)。

4?討論

研究表明，WOPs干預(yù)后，經(jīng)DSS誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，且DAI和CMDI評分明顯降低，表明WOPs對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠疾病狀態(tài)有顯著的改善作用。模型小鼠經(jīng)DSS誘導(dǎo)后結(jié)腸TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯升高，IL-10水平明顯降低。TNF-α由巨噬細胞產(chǎn)生，屬于促炎因子，它也是其他促炎因子的重要啟動因子，具有啟動、放大和延續(xù)全身或局部的炎癥反應(yīng)的作用。TNF-α可刺激機體產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子，而這些炎性因子與UC結(jié)腸黏膜炎癥發(fā)生發(fā)展關(guān)系十分密切[9-10]。此外，TNF-α可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞凋亡，導(dǎo)致上皮通透性增加。同時可通過刺激單核細胞和巨噬細胞增殖分化，大量釋放炎癥介質(zhì)，破壞周邊臨近腸道黏膜，擴大潰瘍面范圍。IL-6可改變結(jié)腸細胞電解質(zhì)分泌狀態(tài)，增加結(jié)腸內(nèi)皮細胞通透性，導(dǎo)致中性粒細胞大量浸潤，加重炎癥反應(yīng)。此外，IL-6的高含量狀態(tài)可使Jak/STAT3通路異常激活，導(dǎo)致UC炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，進一步加重炎癥反應(yīng)[11-12]。IL-10在天然免疫過程中是重要的負調(diào)節(jié)因子，可抑制巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-lβ等促炎因子表達，且不影響抗炎介質(zhì)表達[13]。WOPs處理后，促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達降低，抗炎因子IL-10的表達升高，表明WOPs可通過提高抗炎因子水平、降低促炎因子水平抑制結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DSS誘導(dǎo)的模型小鼠血清中DAO、D-LA和結(jié)腸組織MPO水平明顯增加，表明模型組小鼠黏膜受到明顯損傷。DAO是腸道黏膜上皮細胞中的細胞內(nèi)酶，當(dāng)腸道黏膜上皮細胞損傷時DAO釋放入血，因而血清DAO升高可間接反映腸道黏膜上皮細胞損傷程度[14]。D-LA是細菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物，可通過受損黏膜入血導(dǎo)致血清D-LA水平升高，因此血清D-LA水平可間接反映腸道黏膜通透性變化。MPO主要由中性粒細胞分泌，組織中MPO活性變化可間接反映組織中性粒細胞浸潤的數(shù)量及程度[15]。經(jīng)WOPs處理后，DAO、D-LA、MPO含量明顯降低，表明WOPs能一定程度上修復(fù)黏膜上皮損傷。對小腸絨毛觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DSS誘導(dǎo)的模型小鼠鏡下出現(xiàn)大量以中性粒細胞和淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤。結(jié)腸炎癥破壞腸壁，結(jié)腸組織出現(xiàn)杯狀細胞的缺失。經(jīng)WOPs處理后，小鼠結(jié)腸組織炎性細胞浸潤減少明顯，且隨著WOPs劑量的增加，結(jié)腸杯狀細胞逐漸變?yōu)檎＃砻鱓OPs能夠改善結(jié)腸炎癥細胞浸潤所致的組織損傷，具有一定的恢復(fù)作用。

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