明串珠菌T7產細菌素的特性及共培養對其細菌素產生的影響

生龍娜雍 羅強 關仁梅 張明 劉巧 羅璠

【摘要】前期研究篩選到高產抑菌物質的明串珠菌T7，為探究T7產生的抑菌物質特性及產量，本實驗測定了菌株的生長曲線和pH曲線，通過硫酸銨鹽析粗提抑菌物質，測定了代謝曲線和抑菌特性。以金黃色葡萄球菌為共培養菌，測定了在不同時間點進行共培養對T7產抑菌物質的影響。結果表明：T7的抑菌物質產生與菌體生長相關，在24h時產量最高。T7所產抑菌物質對除α-淀粉酶以外的蛋白酶均有部分敏感性，在pH5.0-10.0均有較高的穩定性。當其與金黃色葡萄球菌共培養時，均能刺激T7產生更高產量的抑菌物質，其中在T7單獨培養至24h時進行共培養刺激產生的抑菌物質最多。

【關鍵詞】生長曲線;抑菌特性;代謝曲線;共培養

【中圖分類號】R-1【文獻標識碼】A 【文章編號】2026-5328（2021）04-001-04

引言

乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類小分子質量、安全無毒的抗菌肽，它能抑制或殺死食物中多數革蘭氏陽性致病菌和腐敗菌且具有良好的熱穩定性[1-2]。根據細菌素的理化性質以及氨基酸結構的不同，可將其分為四類但目前只有乳酸鏈球菌素（nisin）被允許廣泛應用于食品防腐和保鮮，主要原因是其他細菌素大多存在產量低、酸堿耐受性差、抑菌時效短、抑菌譜窄和抑菌機理不明確等因素[3]，不足以滿足工業化生產要求。

如何提高乳酸菌細菌素的產量始終是乳酸菌研究領域的熱點，通常伴隨細菌素合成的是一簇基因的共同表達，可通過細菌素自誘導、共培養誘導等一系列條件來啟動產乳酸菌細菌素相關基因的表達，從而利用誘導物的調控來提高乳酸菌細菌素產量。易華西[4]等以發酵上清液、吸附-解吸法得到的發酵液和陽離子交換得到的發酵液分別加到培養體系中，三種不同條件下得到的上清液均對細菌素的合成有刺激作用，說明細菌素的產生存在自我誘導現象。塔娜[5]等研究了糞腸球菌在不同菌體密度下細菌素H抑菌活性的變化規律，證實了細菌素H受到了群體感應機理的調控。

乳酸菌T7是一株前期從發酵乳中分離得到一株具有較強抑菌能力的乳酸菌株T7。本研究主要擬分析其產生的抑菌物質特性，并采用共培養的方法，探討在種群壓力下其抑菌物質產生有無變化，希望尋找刺激菌種高產細菌素的方法，以期為乳酸菌T7細菌素的進一步開發利用提供前期技術支持。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗菌株

明串珠菌T7分離自藏區傳統發酵酸乳，前期實驗證明其高產抑菌物質;，金黃色葡萄球菌ATCC 25923購于成都鵬世達實驗用品有限公司。

1.1.2試驗試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司;硫酸銨，聚已二醇-20000、甘油、Tris-HCL、乳酸、鹽酸、冰乙酸、氫氧化鈉：上海生工生物工程有限公司;蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α—淀粉酶：德國 Biofroxx公司。所用試劑均為分析純。

培養基：MRS液體培養基，營養肉湯培養基，胰蛋白胨大豆液體（TBS），培養基購自青島海博生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

ST16R高速冷凍離心機：賽默飛世爾有限公司;R40-IIB2超凈工作臺：上海蘇凈實業有限公司;Tanon2500 凝膠成像系統：中國天能公司;GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司;GH6000電熱恒溫培養箱：天津泰斯特設備有限公司;UV1900紫外可見分光光度計：上海佑科儀器;ELX-800酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種的活化

取凍存的明串珠菌T7以5%接種量接種于滅菌MRS液體培養基中，30℃活化24 h。

取保藏金黃色葡萄球菌菌液，以 2%接種量接入5 mL 滅菌胰蛋白胨大豆液體（TBS）培養基，30 ℃培養10 h備用。

1.3.2乳酸菌T7生長曲線及pH曲線測定

取活化后的明串珠菌T7，以5 %接種量接種于100 mL的滅菌MRS液體培養基中，30 ℃培養箱中培養36 h并進行間隔取樣，在600 nm波長下測定OD值，同時使用pH計準確測定pH值。

1.3.3T7發酵上清液制備

取活化菌株以5 %的接種量于100 mLMRS液體培養基中30 ℃靜置培養適當時間，在4 ℃ 6000 r/min離心10 min，去除菌體細胞，制備發酵上清液。

1.3.4鹽析法制備粗提物

在上清液中加入硫酸銨至終濃度達到60 %，4 ℃靜置過夜，10000 r/min 4 ℃離心10 min收集沉淀，用10 mL PBS重溶，轉至截留量3400Da的透析袋除鹽后濃縮至10ml保存。

1.3.5明串珠菌T7細菌素的特性及共培養的影響

1.3.5.1抑菌活性測定

采用平板打孔法測定抑菌活性，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為指示菌。

1.3.5.2抑菌物質產生曲線

在1.3.2的菌株培養過程中，在0h，8h，12h，16h，20h，24h，30h分別取一瓶培養液，制備粗提物，測定不同培養時間抑菌物質的產生量。

1.3.5.3pH穩定性檢測

取粗提取物10ml，均分為10份，將其pH調為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0共10個梯度，室溫處理1h后調至pH6.0，測定抑菌活性。

1.3.5.4不同酶對粗提物抑菌活性的影響

取7ml素粗提物，均分為7份，將其中6份調節pH值到各酶的最適pH，加入1mg/ml的酶液，室溫處理1h，然后調節pH至6.0，以經相同處理但不加入酶的樣品為對照做抑菌活性測定。

1.3.5.5不同共培養條件對抑菌物質產量的影響

乳酸菌T7培養過程中在不同培養時間點加入金黃色葡萄球菌共培養，添加時間點如下表。其中，金黃色葡萄球菌（OD600=1.0）添加量為0.5﹪，以不添加金黃色葡萄球菌作為空白對照，培養至36h測定抑菌活性。

1.4.0數據處理

數據以3 次重復的表示，使用SPSS v24.0對數據進行統計分析，Graphpad prism 8.0軟件繪圖。

2結果與分析

2.1T7的生長曲線圖和pH曲線圖

如圖1所示：乳酸菌T7接種后，約在4h進入對數生長期，在24h左右進入穩定期。而發酵液的pH整體呈現持續下降的趨勢，在對數生長期產酸量大，pH下降明顯，進入穩定期后pH變化趨緩。多數研究表明，細菌素的產生與其菌株生長具有關聯。 章檢明等[6]報道的植物乳桿菌 B23培養時間至12-16 h，p H=7時，最有利于細菌素Lac-B23合成;榮梓嫻等[7]報道的產細菌素屎腸球菌 TRS5在37℃，培養至24 h，pH為6.5時，其細菌素生成量達到最大。

2.2代謝曲線測定

將不同時間段取出的培養液處理得到的粗提取物進行抑菌試驗，結果如圖2所示：乳酸菌T7細菌素粗提物在24h時產生的抑菌物質最多，隨著培養時間增長，其，抑菌物質產量略有下降。研究表明，不同來源細菌素達到最大產量的時間差異較大，張炎等[8]報道的Lactobacillus paracasei細菌素 24h發酵產量最高，高鵬等[9]報道的Lactobacillus plantarum發酵 12h 最大，Perumal[10]等研究的Enterococcus faecalis 細菌素在20 h產量達到最大。

2.3抑菌活性的pH穩定性

T7產生的抑菌物質的pH穩定性結果如圖3：從結果可知，乳酸菌T7發酵液粗提物較穩定，在pH 2-11的范圍內均有抑菌活性。在pH5.0-10.0的范圍內穩定性最高，在強酸條件下，穩定性最差。Kumar等[11]從芒果泡菜中篩選到的干酪乳桿菌LA-1所產細菌素在pH酸性條件下穩定性較差，在pH為6.5時穩定性達到最強。張明[12]等研究屎腸球菌SC-Y112發酵上清液在不同pH條件處理下的抑菌效果是該菌株所產的抑菌物質在弱酸性條件下較穩定，而在堿性條件下不穩定。

2.4酶的影響

選取α-淀粉酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶在最適條件下分別對乳酸菌T7抑菌物質粗提液處理后，結果如圖4所示：α-淀粉酶與對照無明顯變化，說明該粗提物里無糖類成分，其他蛋白酶處理后，抑菌活性均有下降，說明粗提物中含有蛋白質成分，初步證明該抑菌物屬于細菌素類。結果顯示粗提物用蛋白酶k處理后，仍具有一定抑菌活性，說明該物質中含有非蛋白成分。因不同的細菌素氨基酸組成與結構存在差異，所以其對不同蛋白酶的敏感性也有差別。如Lactobacillus plantarum[13]細菌素活性對胃蛋白酶、α-凝乳酶有較強的耐受性，Enterococcus faecalis[14]所產細菌素對胰蛋白酶不敏感，但對胃蛋白酶和蛋白酶 K敏感。

2.5不同共培養條件對細菌素產量的影響

由圖5結果可見，在不同時間加入金黃色葡萄球菌進行共培，均促使T7的抑菌物質產量增加，在T7培養到24 h加入金黃色葡萄球菌共培后，T7最終產生的抑菌物質的量最大，其抑菌圈直徑達到了22.1±0.9。許多研究證明，細菌物質的產生依賴于菌體密度，受到群體感應系統的影響，王筱夢[15]的研究結果也證實了這一點。

3結論

隨著對細菌素的深入研究， 生物防腐劑廣泛應用于食品工業成為大趨勢，這不僅會給消費者提供更安全更健康的食品， 而且會為食品工業帶來一場重要的變革。本研究從乳酸菌T7中初步提取出其產生的抑菌物質，對其抑菌特性進行了研究，證明該種抑菌物質具有蛋白質性質，有較好的pH穩定性，該種抑菌物質的代謝與菌體生長直接相關，可能受到菌體密度的調節，當T7與金黃色葡萄球菌共培養時，其抑菌物質的產生會受到誘導，提示T7可能存在群體感應系統。

本研究對細菌素的抑菌作用進行了部分探討，但細菌素的作用機制、合成及分泌運輸還可進一步研究。雖然細菌素具有高效性、安全性、應用范圍廣、其添加不改變產品風味和病原菌對其不易產生抗性等諸多優點，也已廣泛應用于醫學治療、食品防腐和飼料業等，但其產量低、易失活、敏感細胞抗性的出現、尋找專一性的細菌素等諸多困難問題有待我們去探究解決。

【參考文獻】

[1]斯日古楞，張潤平，周瑞峰.乳酸菌的生理功能及其作用機理[J].飼料與畜牧，2012（06）：49-51.

[2]Fang Z，Wu Z，Wu Z，et al.Effect of ionic strength on the foam separation of nisin from the fermentation broth[J].Separation & Purification Technology，2011，78（1）：42-48.

[3]周佳，劉書亮，胡欣潔.產寬譜pH細菌素乳酸菌的篩選鑒定、毒力檢測及細菌素特性研究[J].食品科學，2012，33（11）：194-199.

[4]易華西.分泌廣譜抗菌肽乳酸菌的篩選及高效表達的調控研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學，2010.

[5]塔娜.對產細菌素的糞腸球菌群體感應現象的研究[D].內蒙古：內蒙古農業大學，2013.

[6]章檢明.植物乳桿菌 B23合成細菌素發酵條件優化及誘導調控研究[D].c哈爾濱：哈爾濱工業大學，2015.

[7]榮梓嫻，王蓉蓉，肖茜，等.產細菌素屎腸球菌 TRS5 特性分析及其編碼基因的擴增[J].食品科學，2017，38（08）：6-10.

[8]張炎，房保柱，平文祥，等.副干酪乳桿菌HD1.7高密度培養產細菌素Paracin1.7條件優化[N].中國農學通報，2020，36（24）：116-124.

[9]高鵬，韓金志，陸兆新，等.廣譜抗菌乳酸菌的分離鑒定及細菌素的提取和純化[J].食品科學，2016， 37（11）：160-166.

[10]PERUMALV，VENKATESAN A.Antimicrobi al，cytotoxic effect and purification of bacteriocin from vancomycin susceptible Enterococcus faecalis and its safety evaluation for probiotization[J].LWT - Food Science and Technology，2017，78： 303-310.

[11]Kumar M，Jain A K，Ghosh M，et al.Statistical optimization of physical parameters for enhanced bacteriocin production by L.casei[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2012，17（3）： 606-616 .

[12]張明，羅強，魏婕，等.產細菌素屎腸球菌的篩選鑒定及其抑菌特性[J/OL].食品科學：1-19.

[13]陳曉靜，李向陽，冉軍艦.藏靈菇中乳酸菌的鑒定及細菌素生物特性研究[J].食品科技，2019， 44（01）：20-25.

[14]沈勇，劉文茹，梅俊，等.花鱸魚腸道中產細菌素糞腸球菌的篩選和抑菌效果研究[J].食品與發酵工業，2019，45（14）：15-19.

[15]王筱夢，江蕓，孫芝蘭，劉芳，王道營，諸永志，耿志明，徐為民.1株產細菌素乳酸菌的鑒定及所產細菌素的誘導合成現象[J].食品科學，2016，37（21）：170-175.

作者簡介：生龍娜雍（1997-6），性別：女，民族：藏族，籍貫：四川康定，學歷：在讀碩士，單位：西南民族大學，研究方向：食品微生物，單位所在省市和郵編：四川成都 610041

基金項目：中央高校基本科研業務費專項資金優秀學生培養工程項目（0217-3300220345）

通訊作者：羅璠，副教授，E-mail： luofany77@163. com

1.西南民族大學?食品科學與技術學院?四川 成都?6100412.西南民族大學 畜牧獸醫學院?四川成都 610041