A型流感病毒M基因的研究進展

喬樹苗，顧 敏,2,3*，劉秀梵,2,3*

(1.揚州大學 農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇 揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

1 A型流感概述

流感病毒有4種型：A、B、C和D型，其中感染宿主最多樣并能引起大流行的是A型流感病毒(influenza A virus,IAV)。進一步根據表面糖蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的差異，IAV可被分為18種HA亞型和11種NA亞型。而依據宿主來源，IAV又可被分為人流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒或其他動物源的流感病毒[1-2]。IAV是分8個節段的負鏈RNA病毒，每個基因節段均與三聚體的病毒聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)以及核蛋白(NP)結合形成病毒核糖核酸蛋白復合體(vRNP)[3]。已知IAV的基因組可編碼多達17種蛋白，其中由第7節段M基因所編碼的M蛋白是除HA、NA之外的膜蛋白，包括基質蛋白M1(matrix protein 1)、離子通道蛋白M2(ion channel protein)和M42蛋白(M2-null protein)[4-11]。

研究指出，M基因轉錄后通過不同剪接方式可產生4個剪接轉錄本。M1蛋白由mRNA未經剪接的MmRNA1轉錄產生；M2蛋白由mRNA選擇性剪接產生的MmRNA2轉錄產生；而M42蛋白則由選擇性剪接產生的MmRNA4轉錄產生，是一種新的M2相關蛋白，但具有不同于M2的外顯子結構域，其胞外結構域的抗原性也與M2蛋白不同，可以在功能上代償M2蛋白缺陷型病毒中M2蛋白的作用[12-13]。值得注意的是，另外一個剪接轉錄本MmRNA3不編碼蛋白，但與MmRNA2具有相同的剪接位點，當其遠剪接位點被聚合酶所阻斷方能啟動MmRNA2的剪接，因此MmRNA3能夠在病毒感染早期充當M蛋白表達的負調控因子[14-16]。此外，M基因mRNA的剪接調控還受到發現于細胞周期蛋白激酶抑制劑中的KH-CB19及其類似物NIH39等剪接調控因子抑制劑的影響。 ARTARINI等[17]研究發現在宿主因子中的細胞分裂周期樣激酶1(CLK1)是M基因mRNA剪接必要的相關因子，可以與KH-CB19和NIH39進行特異結合，從而影響M基因的剪接水平并能降低IAV在A549細胞中的復制[18-19]。

2 M基因的遺傳進化

根據IAV的感染宿主差異，M基因可被劃分為7個進化譜系(圖1)，分別為：人譜系Hu1、Hu2，禽譜系Av1、Av2，豬譜系Sw1、Sw2和犬/馬譜系CE[20]。其中，人譜系Hu1，包括1918—1954年的H1N1亞型病毒(西班牙流感及其子代病毒)、1957—1967年的H2N2亞型病毒(亞洲流感及其子代病毒)以及1968年之后的H3N2亞型病毒(香港流感及其子代病毒)；而Hu2主要由1977年以后出現的H1N1亞型病毒(俄羅斯流感)所組成[21-22]。進一步的分析發現，Hu1譜系的M基因均從1918大流感病毒衍生而來，雖經歷過1957和1968年流感病毒的2次抗原轉換，但仍保持著相同的來源；而Hu2譜系M基因盡管最初也來自1918年大流感病毒，但其經歷不同的進化過程而形成另一個譜系[22]。禽譜系Av1主要包括來自亞洲的禽流感病毒，Av2則大多來自北美[23]。豬譜系Sw1，位于人和禽譜系之間，主要是北美來源的病毒；而另一個豬譜系Sw2，則從禽譜系Av1分化而來，由1980年后的豬流感病毒所組成，主要來自歐洲[24]。犬/馬譜系CE(圖1)，從Av2分支的根部分化而來，包括H3N8、H3N2、H7N2等亞型的犬流感病毒或馬流感病毒[20,25-26]。通常，上述不同譜系的M基因具有宿主特異性，但豬或禽譜系中的IAV也會導致人感染，例如已知感染人或豬的H5N1亞型病毒均具有禽流感病毒基因組特征，包括禽譜系的M基因[27-28]。

圖1 M基因進化譜系簡圖[20]

研究表明，盡管M1和M2均由IAV的M基因編碼，但兩者在不同宿主體內受到的選擇壓力存在差異，表現為獨立進化。 FURUSE等[29]通過對獲取自GenBank 數據庫的流感序列進行M基因的進化分析指出，M2受到的選擇壓力要大于M1。 NAGUIB等[30]研究也發現，禽流感病毒M2承受著大于M1的選擇性壓力；但人流感病毒M1基因所受選擇性壓力又要強于禽流感病毒。祁賢等[31]還指出，M1蛋白的第219位氨基酸在人流感病毒中被鑒定為正選擇位點，而該位點在結構上與T細胞和MHC細胞抗原表位有關。此外， BOGDANOW等[32]研究發現M基因在禽適應株和人適應株上具有不同的保守區，其RNA剪接異構體的增加會造成在非適應宿主上M1蛋白不能有效地產生，從而影響病毒對宿主的適應。并且，CALDERON等[33]研究也發現M2蛋白會影響IAV在宿主上的適應與傳播，M2過度表達使得IAV在非適應宿主上的復制明顯減少。

3 M基因對病毒形態的影響

IAV粒子的囊膜具有多形性，主要為球形和絲狀，大小從80～120 nm到幾微米，相關的試驗證明M1、M2蛋白的關鍵氨基酸殘基以及M1和M2蛋白間的相互作用可能影響流感病毒的形態[34-35]。為病毒膜提供結構和支撐的同時，M1蛋白的結構和功能還決定病毒形成絲狀或球形病毒粒子的能力，M1蛋白在病毒膜下形成螺旋網，但其螺旋轉彎的節距在絲狀和球形病毒粒子中不同。LIU等[36]研究表明A/PR8/1934(H1N1)球形病毒經反復傳代，其絲狀病毒粒子的增加主要與M1蛋白第87,92,101，157位氨基酸的累積突變相關，通過建模發現這些殘基均位于M1二聚體帶正電荷的表面。 LIU等[37]還發現M2蛋白胞質尾區第76位酪氨酸到丙氨酸的突變(Y76A)會減少感染性病毒顆粒的產生和細絲狀病毒粒子的形成。由于M2蛋白的尾部在與M1結合的過程中具有重要作用，因此M2尾部基因的突變也會改變M1蛋白對絲狀病毒粒子形成的影響[38]。

4 基質蛋白M1

作為IAV包膜的主要成分，基質蛋白M1在流感病毒生命周期的多個階段均起著重要的調控作用，包括脫衣殼、轉錄、vRNP的核輸出、組裝和萌發[39]。

M1是IAV顆粒中含量最多的蛋白，位于病毒膜內層；pH為4時以二聚體形式存在，pH為7.4時則以多聚體形式存在[40]。M1基因序列高度保守，由252個氨基酸組成，顯微鏡下呈現1個球形N端結構域和1個靈活的C端延伸部分[41-43]。N端結構域由分別位于2～67和91～158位氨基酸，2個四螺旋束經1個螺旋結構連接而成，88～164位氨基酸構成的中間結構域介導M1的寡聚并連接vRNP和病毒包膜，C端結構域則由165～252位氨基酸折疊成螺旋并包含一個明顯的非結構化區域[44-46]。

IAV子代病毒在細胞膜萌發的過程中，新復制的vRNP需要穿過核膜到達細胞質，才能與內小體一起沿著微管運輸到病毒出芽點[47]。然而，病毒出芽部位的HA和NA簇位于質膜上，HA蛋白雖能啟動病毒復制但卻無法完成病毒萌發。進一步研究發現，M1可能與HA和NA的細胞質尾區域發生相互作用，導致細胞膜彎曲而協助病毒脫衣殼[47-49]。M1既介導對HA誘導病毒出芽的限制，也介導出芽過程所需其他病毒蛋白的招募。M1蛋白能夠在病毒復制時直接結合vRNP和核輸出蛋白NEP，形成包含有2個核輸出信號(NESs)的核輸出復合體，同時將vRNP從細胞核運送到細胞質并輔助vRNP組裝成病毒顆粒[50-51]。另外，M1還可通過與多種宿主細胞因子互作來調控流感病毒的復制，如WATANABE 等[52]研究發現熱休克蛋白HSC70與M1的結合能夠抑制M1和NP的核輸出，進而抑制病毒復制并影響到病毒的毒力和致病性。

5 離子通道蛋白M2

離子通道蛋白M2是一種具有離子通道活性的跨膜蛋白，在病毒粒子進入宿主細胞、組裝、萌發中起重要作用。M2離子通道活性不僅是病毒復制所必須的，而且通過多種途徑參與調節細胞內穩態，同時也是離子通道抑制劑型抗流感藥物如金剛烷胺、金剛乙胺等的靶點[53-54]。

M2是一種單通道Ⅲ型膜蛋白，錨定于病毒包膜中，由二硫鍵連接的一對二聚體或四聚體所組成，包含97個氨基酸(M基因第26～51位和第740～1 007 位核苷酸編碼)[42,53]。結構上，M2蛋白依次分為胞外區N-末端胞外結構域(ED，1～24位氨基酸)、中間跨膜區(TMD，25～43位氨基酸)、胞內區和C-末端結構域(CTD，44～97位氨基酸)，其中CTD又由兩親性螺旋(APH，45～62位氨基酸)和細胞質尾部(CT，63～97位氨基酸)所組成[56-59]。

5.1 M2蛋白的離子通道活性M2蛋白形成的質子選擇性離子通道受細胞環境pH調節，當酸性環境pH值較低時該通道被激活，在vRNP釋放到宿主細胞胞質的過程中起重要作用。病毒在受體介導內吞、入侵宿主細胞時，內小體質膜pH降低，運輸囊泡將新合成的病毒包膜蛋白(包括M2、HA、NA蛋白)從內質網運輸至高爾基體，最終到達細胞膜。通過高爾基體時，離子通道形成的酸性環境將經由溶酶體或者蛋白酶體降解途徑來促進轉運蛋白的降解，使得胞質中vRNP釋放轉運到細胞核中，幫助病毒脫殼和釋放[60-61]。此外，M2蛋白能夠阻止LC3II蛋白與自噬體結合從而干擾細胞自噬，參與病毒在細胞內的脫膜過程[38,47,57]。 BEALE等[62]研究發現，M2胞質尾區不僅含有一個從胞膜出芽所必需的α-螺旋區(45～61位氨基酸)，還包含與膽固醇識別及互作密切相關的氨基酸共識(CRAC)區域和一個與LC3互作的區域(91～94位氨基酸)，該區域的存在能夠破壞自噬、維持病毒粒子穩定性。

5.2 M2蛋白與宿主蛋白的相互作用M2蛋白在進入細胞膜的過程中，其胞外區和胞內區直接接觸細胞質，與細胞蛋白存在相互作用。M2蛋白可以通過調節pH水平影響細胞其他蛋白的表達，其胞外區被宿主的免疫系統識別后可干擾宿主蛋白并引起宿主細胞炎性因子激活和功能紊亂。TAKESHI等[63]研究表明，M2蛋白的離子通道活性是流感病毒激活單核巨噬細胞和樹突狀細胞中的炎癥小體所必需的。GUAN等[64]研究發現NS1/M2介導的PKR通路有助于流感病毒的復制與釋放，協同熱休克蛋白Hsp-p58活化PKR通路，促使細胞死亡以及病毒釋放[65]。

6 總結

預防流感的有效方法之一是使用疫苗，然而現有的疫苗設計多聚焦于HA和NA蛋白所提供的免疫保護作用，但由于這兩種表面糖蛋白的抗原性變異，需要定期地對疫苗株進行更新以確保其與流行株具有良好的抗原匹配，因此研發抗病毒藥物以尋求更廣泛或更“普遍”的抗病毒作用也顯得至關重要。目前，M2離子通道阻滯劑和NA抑制劑是已投入臨床使用的兩種主要的抗流感藥物；而相較于NA，M2蛋白的結構更加穩定，其抑制劑類藥物也相對更為廣譜。另外，基質蛋白M1在流感病毒的生命周期中，尤其是病毒出芽過程發揮關鍵作用。因此，進一步研究M1和M2蛋白的結構與功能關系、宿主蛋白所介導M2蛋白在諸如vRNP釋放和萌芽等過程的作用，有助于深入理解M基因在流感病毒感染與致病中的相關機理，并靶向M基因開發具有跨亞型保護效果的通用性疫苗或針對IAV復制周期特定階段的新型抗病毒藥物，從而有效應對新型重組IAV、耐藥性IAV的出現及其潛在風險。