引起人工授精種雞產蛋下降的鴨源雞桿菌的分離鑒定

張玉杰，劉 東，孫 寧，劉紅祥，高天佐，郭玉廣，于 靜，袁 飛，宋姍姍，王玉超，鐘 聲，馬 冬，張宇龍，杜元釗*

(1.青島易邦生物工程有限公司 動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東 青島 266114；2.山東省青島第一中學，山東 青島 266002)

KJOS等[1]在1950年首次報道了鴨源雞桿菌，CHRISTENSEN等[2]于2003年將巴氏桿菌科中的鴨巴氏桿菌、輸卵管炎巴氏桿菌和溶血性巴氏桿菌單獨成立為雞桿菌屬，BISGAARD等[3]于2009年進一步將鴨源雞桿菌明確為雞桿菌屬的一個代表種。雞、火雞、鴨、鵝、鸚鵡、鷓鴣和珍珠雞等[4]各種禽類中都可以分離出雞桿菌，從具有不同臨床癥狀的禽類中可以分離到不同的雞桿菌屬細菌[5]。研究表明，雞桿菌可以從健康的禽類中分離到，有人認為這些細菌可能是上呼吸道和下生殖道正常微生物群的一部分[6]；與此相反，諸多研究[7-12]從患生殖系統疾病的蛋雞中亦可分離到雞桿菌，并認為該病原菌是開產蛋雞輸卵管炎、輸卵管囊腫和敗血癥的潛在致病菌，進而導致產蛋量和蛋的品質下降。此外，該病原菌還能造成患有免疫抑制疾病的雞群較高的死亡率[13]。國內關于該菌的研究主要局限于菌株分離培養特性，但對于該菌在臨床上的危害以及實驗室相關動物回歸試驗數據尚無人論證。王川慶等[14]于2008年首次報道了鴨源雞桿菌在我國的存在，鄭鹿平等[15]于2010年從64只患輸卵管炎雞的不同臟器中分離鑒定到45株鴨源雞桿菌，方翟等[16]于2014年從患腺胃腫大的10日齡雛雞腺胃內分離到1株鴨源雞桿菌。自2000以來，我國一些規模化種雞場每批雞群在開產后人工授精均會出現產蛋量和孵化率雙雙下降的情況，并且有愈演愈烈的趨勢，給養雞企業造成了巨大的經濟損失。為弄清楚本病的病因，本研究從山東、遼寧和河南采集發病種雞疑似樣品，通過病毒和細菌的分離鑒定以及動物回歸試驗，確定了引起開產種雞人工授精后產蛋量下降和孵化率下降的病原為鴨源雞桿菌，進而為該病的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料、雞胚及實驗動物64份病料樣品(主要包括氣管、肺臟、腹膜、肝臟、脾臟、膽囊、心臟、泄殖腔、卵泡、輸卵管、睪丸和精液)來自2020年山東、遼寧、河南8個不同養殖企業的發病雞場；6日齡、10日齡SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；11日齡SPF鴨胚，購自哈爾濱獸醫研究所；188日齡海蘭褐蛋雞，購自河北華裕農業科技有限公司。

1.2 主要試劑LB培養基、TSA培養基、TSB培養基(美國BD公司)；綿羊血平板培養基(青島海博生物技術有限公司)；馬血清(HyClone公司)；Column Viral RNAout(TIANDZ 71001)；Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 R004A)；DL2000 DNA Marker (TaKaRa 3427Q)；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2.0(TaKaRa RR055A)；pMD19-T Vector(TaKaRa 6013)；E.coliDH5α competent cells(TaKaRa 9057)；DNA gel extraction Kit(BioFlux BSC02M1)；藥敏片(杭州微生物試劑有限公司)；雞桿菌鑒定引物參考KORCZAK等[17]及BOJESEN等[18]方法，根據GenBank上公布的鴨源雞桿菌16S rRNA序列，運用Primer 5.0軟件設計引物，用于擴增16S rRNA基因全長，以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3 病毒分離無菌采集病雞輸卵管、卵泡和肝臟等組織，棄掉卵泡內卵黃，將卵泡膜、輸卵管和肝臟剪碎后，加入適量生理鹽水，勻漿器勻漿后加雙抗各1 000 U，反復凍融3次，4℃、8 000 r/min離心15 min，吸取上清液，0.22 μm濾器過濾除菌。將上述濾液經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚20枚，12日齡SPF鴨胚20枚，0.2 mL/枚。接種后置于37℃生化培養箱恒溫孵化。棄掉24 h內死亡的雞胚和鴨胚，連續觀察5 d，收獲接種24 h后的雞胚尿囊液和鴨胚尿囊液，-80℃凍存備用。按照上述方法盲傳3代。

1.4 支原體的分離培養無菌取病雞輸卵管、卵泡，將卵泡內卵黃棄掉，用無菌生理鹽水沖洗數遍后用高壓滅菌后的研缽研磨輸卵管和卵泡膜，加入適量的無菌生理鹽水充分渦旋，4℃靜置1 h，取上清用0.45 μm無菌濾器過濾除菌后經卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，37℃培養7 d。棄掉24 h內死亡的雞胚，收獲接種24 h后的雞胚卵黃膜，并連續盲傳3代。

1.5 細菌的分離、純化及鑒定打開病雞腹腔，剖開輸卵管，用高壓滅菌的棉棒蘸取輸卵管壁表面和病變的卵泡表面后浸入盛有適量生理鹽水的2 mL離心管中，無菌摘取公雞睪丸置于超凈工作臺酒精燈周圍，用燒紅的刀片將睪丸縱向切開，用無菌棉棒蘸取睪丸內容物后浸入盛有適量生理鹽水的2 mL離心管中，將以上樣品充分渦旋后，吸取0.2 mL液體于3%馬血清TSA平板上，并用涂板器涂抹均勻，37℃培養過夜；挑取疑似菌落于3%馬血清的TSB培養基中，37℃、2 00 r/min搖菌培養過夜。參照文獻[17-18]，利用雞桿菌保守基因rpoB、16S rRNA和23S rRNA鑒定引物對菌液進行PCR鑒定，將陽性菌液劃線于3%馬血清的TSA培養板上，如此重復直至TSA瓊脂平板菌落單一。將純化后的菌落分別接種麥康凱培養基、綿羊血瓊脂平板，觀察其生長特性。

1.6 藥敏試驗參照CLSI標準進行操作[19]，采用K-B紙片擴散法對臨床分離株進行藥物敏感性測試，其中包括紅霉素、林可霉素、普那霉素、阿奇霉素、阿莫西林、泰樂菌素、多黏菌素E、利福平、大觀霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋、復方新諾明、丁胺卡那霉素、慶大霉素、磺胺甲惡唑、氟甲喹、惡喹酸、恩諾沙星、呋喃妥因、夫地西酸、甲硝唑 21種抗生素；采用瓊脂平皿稀釋法測定26株臨床分離菌對以上21種藥物的最小抑菌濃度(MIC)，結果按照CLSI標準進行判斷。

1.7 分離菌株的同源性及親緣關系分析用16S rRNA基因全長引物對臨床分離株進行PCR特異性擴增，將電泳得到的陽性目的條帶回收后，連接pMD19-T載體并轉化大腸桿菌 DH5α感受態，AMP+/LB固體培養基培養后挑取疑似菌落搖菌后送上海生工生物工程股份有限公司測序。用DNAStar軟件將所測序列與GenBank中收錄的巴氏桿菌科菌株進行同源性比對，用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

1.8 動物回歸試驗將40只22周齡健康海蘭褐蛋雞平均分為5組，8只/組，飼養在裝有通風管道并能提供過濾空氣的封閉房間，光照、通風、飲水和飼料等嚴格執行海蘭蛋雞飼養管理方案。攻菌前1周，采集每只雞的泄殖腔拭子和咽拭子樣本進行細菌分離，所有試驗雞只雞桿菌檢測均為陰性。

雞群在135日齡，開始按照表2試驗設計進行試驗，1,3組只進行1次攻菌，2,4組隔4 d進行2次攻菌，5組為對照。每天觀察雞只是否有臨床異常，每日下午17:00點收集各組雞蛋并記錄數量。分別于攻菌后3,5,7 d采集每組雞只的泄殖腔拭子和生殖道拭子(無菌棉棒進入深度至少6 cm)進行細菌分離，試驗過程共持續31 d，試驗結束后將所有雞只處死尸檢、取樣并進行細菌分離。

表2 試驗設計

2 結果

2.1 病毒及支原體分離培養66份樣品接種SPF雞胚和SPF鴨胚，經盲傳3代，均無死亡現象，胚體無異常，尿囊液無血凝活性，未發現疑似病毒；經卵黃囊接種后，均未分離到支原體。

2.2 細菌的分離、純化和鑒定結果從66份樣品中分離到66株鴨源雞桿菌，分離菌大多定植于開產母雞輸卵管和卵巢、性成熟公雞精液和睪丸，其他臟器如肝臟、氣管和肺臟等幾乎分離不到，公雞泄殖腔拭子排菌率亦較高，但母雞泄殖腔拭子排菌率很低(表3)。

分離菌在TSA培養基上呈針尖樣，添加3%馬血清后生長旺盛，形成圓形、灰白、半透明、邊緣整齊，直徑1～2 mm的小菌落(圖1A)。在綿羊血瓊脂平板上呈β溶血(圖1B)。光學顯微鏡下觀察呈短小桿狀，革蘭染色陰性(圖1C)。在麥康凱瓊脂平板上不生長。

表3 66份樣品中不同臟器鴨源雞桿菌分離情況

圖1 菌落在TSA(A)、血平板(B)及革蘭染色后光學顯微鏡(C)下圖片

2.3 藥敏試驗結果不同分離菌株對以上21種抗生素均存在較強的耐藥性，只有慶大霉素和丁胺卡那霉素對個別菌株有一定效果，整體表現為該菌無敏感抗生素。

2.4 分離菌株的同源性及親緣關系分析66個臨床分離株的16S rRNA序列同源性高達99.9%，與GenBank中收錄的鴨源雞桿菌同源性最高，均在99.8%以上，處于同一進化分支(圖2),這表明試驗中的臨床分離株細菌均為鴨源雞桿菌。

▲.從不同雞場分離的鴨源雞桿菌菌株

2.5 動物回歸試驗結果試驗1組自攻菌后3 d開始吃料速度減慢，采食量下降，較對照組減料最高5 g/d，持續時間為3～4周,然后開始緩慢恢復，期間試驗3組無任何異常；試驗2組1次攻菌后情況與試驗1組一致，并于2次攻菌后2 d減料達到最高10 g/d(表4)，持續時間為4～5周,然后開始緩慢恢復，同時于2次攻菌后5 d開始出現打蔫現象，個別雞只拉黃色泡沫樣稀糞，期間試驗4組無任何異常；試驗1組尤其是試驗2組攻菌雞只生殖道均出現嚴重程度不一的炎癥反應，外翻困難，個別雞只生殖道有炎性分泌物流出，與現場實際發病情況完全一致；整個試驗過程中，對照組雞只一切正常。

試驗1組在攻菌后10 d出現一過性產蛋下降，但自攻菌后23 d開始，日產蛋率從87.5%～100.0%降到75%左右，并維持在這一水平(圖3)，所產雞蛋蛋殼質量正常。試驗2組自2次攻菌后5 d開始，出現劇烈的降蛋現象，日產蛋率從87.5%～100.0% 降到0.0%～25.0%，有的雞只甚至絕產，隨著時間的推移，日產蛋率開始逐漸恢復，但不能恢復到發病前的水平，最后日產蛋率在50%左右徘徊(圖3);產蛋中后期個別雞只所產雞蛋蛋殼質量差，皮薄、易碎(圖4A)，絕大多數雞蛋的蛋清和蛋黃正常，僅少數雞蛋的蛋清稀薄。試驗3，4組和對照組均正常。

表4 攻菌后各組雞群的臨床表現

圖3 攻菌前后各組雞群的平均日產蛋量統計

試驗1，2組自攻菌后3，5，7 d的泄殖腔拭子中極難分離到鴨源雞桿菌，而從對應雞只的生殖道拭子中均能分離獲得大量菌落形態單一的鴨源雞桿菌，但試驗結束后的雞泄殖腔和生殖道拭子均未分離到鴨源雞桿菌(表5)。試驗結束后，剖檢所有試驗雞只，發現試驗1組尤其試驗2組雞只均出現不同程度的生殖系統病變，卵泡充血、變形、液化，破裂后卵黃跌入腹腔形成腹膜炎，輸卵管囊腫、積液、內有白色干酪物(圖4B，C)，與現場剖檢變化一致，其他臟器無異常。試驗3，4組和對照組均無異常。

表5 攻菌后不同時間的細菌分離結果

A.白色虛線框內為試驗2組所產雞蛋，左側為試驗5組所產雞蛋；B.試驗2組雞輸卵管；C.試驗2組雞輸卵管和卵泡

3 討論

鴨源雞桿菌在雞體內分布廣泛，已報到該菌可以定植于雞的呼吸系統、生殖系統和消化系統[20-23]。通過口鼻途徑模擬自然感染的研究結果表明，在試驗過程中能夠從高頻率的雞上呼吸道檢測到鴨源雞桿菌，故而認為鴨源雞桿菌感染的靶器官為呼吸道和生殖道，但雞群上呼吸道既無任何呼吸表征又無肉眼和顯微鏡下可見的病變[24-25]；后來，PAUDEL等[26]試驗結果表明盡管可以不斷從試驗雞上呼吸道中分離到病原，但該菌對呼吸道無致病性，卻造成卵巢明顯的損傷，因此認為鴨源雞桿菌是一種專嗜生殖型而非呼吸型病原體[27-28]。本研究從發病公雞睪丸、精液以及發病母雞輸卵管中分離到大量鴨源雞桿菌，其他器官則較少，這與鄭鹿平等[15]從氣管分離率最高的研究結果有差別。首先，可能是發病時期不同，發病初期和發病后期的細菌分離結果對于病因的確定影響很大，前者采集的是發病初期樣品，而后者采集是發病后期樣品；其次，感染途徑不同，前者人工授精是通過生殖道感染，后者自然感染是通過口鼻；是否符合“柯赫氏法則”，前者是從人工授精后發病母雞的輸卵管和公雞的睪丸中分離到的鴨源雞桿菌，并通過回歸蛋雞試驗復制出了與臨床發病完全一致的病例，而后者是從患輸卵管炎的“假母雞”體內分離到的鴨源雞桿菌，且回歸SPF雞試驗未復制出與臨床發病完全一致的“假母雞”病例。在2010年前后，我國蛋雞發生了嚴重的“假母雞”或“水袋子雞”病，后經研究確定該病是由雞傳染性支氣管炎病毒所引起[29-30]，單純的鴨源雞桿菌并不能引起“假母雞”或“水袋子雞”現象，該菌可能是繼發感染。基于以上研究，正常情況下，鴨源雞桿菌主要存在于上呼吸道，生殖系統幾乎不存在，雞帶菌卻不發病，受應激等因素，一旦該菌侵入生殖系統，則引起嚴重的生殖障礙疾病。

鴨源雞桿菌作為巴氏桿菌科雞桿菌屬中的代表種，人們對其致病性及致病機理一直不甚明確。NEUBAUER等[20]從患生殖系統疾病的蛋雞體內分離到了鴨源雞桿菌，并認為該菌與開產蛋雞的產蛋下降、腹膜炎和輸卵管炎有關；PAUDEL等[31]通過滴鼻攻菌的方式回歸動物證明鴨源雞桿菌可以導致SPF雞發生產蛋量下降、蛋殼質量變差以及較低的死亡率。早在2000年前后，我國就有關于種雞人工授精后產蛋下降的報道[32]，當時由于試驗條件的限制，大多認為該病是病毒性傳染病，如雞產蛋下降綜合征(EDS-76)病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和禽腦脊髓炎病毒等[33-35]。本研究通過對分離菌回歸蛋雞試驗驗證，復制出了與臨床發病相一致的病例，初步確定了引起開產種雞人工授精后發生產蛋下降、蛋殼質量變差的病原為鴨源雞桿菌，特別是通過模擬人工授精這一攻菌方式，直接佐證了該菌作用的靶器官主要是生殖系統，對該菌的致病機理研究具有重要意義。

王珊等[36]對我國部分地區的蛋雞群進行了鴨源雞桿菌血清學調查，檢測樣本的鴨源雞桿菌抗體陽性率為45.06%，不同省份的血清抗體陽性率差別較大，羅曼雞的血清陽性率比海蘭雞高，開產前蛋雞的血清陽性率低于開產后，但雞群健康，說明通過口鼻的自然感染途徑難以使動物發病，即病原菌既不能引起雞群呼吸道疾病，又難以到達感染的靶器官生殖系統，最終雞群健康帶菌。緣何臨床上人工授精后的雞群頻頻發病呢？推測原因，一是養雞場內存在鴨源雞桿菌污染，場內雞群通過口鼻途徑自然感染鴨源雞桿菌并通過泄殖腔不斷向環境中排菌，工人在采集公雞精液過程中，鴨源雞桿菌由泄殖腔通過精液上行感染至生殖器，嚴重的會進入公雞睪丸內，鴨源雞桿菌在公雞睪丸內大量繁殖，產生的精液中含有大量鴨源雞桿菌；二是采集不同公雞的精液過程中存在嚴重的交叉感染現象，進一步對感染個體進行了放大；三是污染鴨源雞桿菌的公雞精液通過高頻率的人工授精方式將鴨源雞桿菌不斷地輸入開產母雞生殖道，加之開產母雞性成熟后生殖系統對外界刺激高度敏感，最終導致雞群發病。

NASSIK等[37]首次從摩洛哥產蛋下降的蛋雞分離到了鴨源雞桿菌，分離株對恩諾沙星、氟苯尼考和慶大霉素敏感。一些研究[38]發現，隨著抗生素的使用，鴨源雞桿菌的耐藥性會逐漸增強。DRIESSCHE等[27]從牛的支氣管肺泡中分離到了一株廣泛耐藥的鴨源雞桿菌，該分離株對各類抗生素均不敏感，同一農場分離到的不同分離株之間存在很大的遺傳變異。本研究中分離的66株鴨源雞桿菌對不同抗生素均存在較強的耐藥性，這表明鴨源雞桿菌在環境中存在已久，加之對該菌的危害以及防治缺乏科學的認識，大量濫用抗生素，導致該菌的耐藥譜越來越廣。一些前期報道敏感的抗生素如頭孢菌素和阿莫西林等，對該菌已經不起作用，這說明該菌已經具有多重耐藥性，在抗生素壓力下，各地分離株獲得的耐藥基因越來越多。

臨床上，許多人工授精病例還會出現種蛋受精率和雛雞孵化率嚴重下降的情況，說明鴨源雞桿菌具有垂直傳播的潛在可能，這對養禽業影響很大。有研究[39-40]報道從患鴨源雞桿菌的病雞所產蛋中能夠分離到鴨源雞桿菌，雖然分離率較低，說明該菌可以垂直傳播，但缺乏該菌對受精率和孵化率的研究。本研究受實驗動物的限制，未能在種雞上進行動物回歸試驗，后續的相關研究將圍繞這點展開。

鑒于該菌較強的耐藥性，普通抗生素又很難通過血-睪屏障和血-卵屏障，因此，該病需要嚴格的生物安全凈化措施。通過藥敏試驗篩選敏感抗生素用于陰性雞群的一般性預防及陽性雞群的程序性治療，商品化的疫苗可能對該病的防治具有事半功倍的效果。