藤茶及牛蒡子配伍對耳足致炎鼠的影響

李曉青，張 雷，趙雅欣，孫 睿，雷 雨*

(1.廣東潤良藥業有限公司，廣東 珠海 519000；2.北京市密云區衛生健康委員會，北京 101500；3.北京聯合大學 應用文理學院，北京 100083)

咽炎在中醫說法中為“喉痹”、“慢火喉痹”等，是耳鼻喉科常見病之一[1]。慢性咽炎因諸多因素導致，大多為臟腑虛損、咽喉失養、痰凝血瘀，結聚咽喉[2]。近年來，隨著空氣質量的持續惡化和人們生活習慣的改變，咽喉極易受到影響而引起一系列問題，嚴重影響患者的生活質量。開發安全有效的清咽功能保健食品迫在眉睫。中醫藥主張未病先治的理論符合現代人保健養生的需要。某清咽產品將藤茶及牛蒡子進行配伍，其中藤茶(Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang)又名顯齒蛇葡萄葉，性味苦、微澀、涼，常用于清熱利濕，平肝降壓，活血通絡。牛蒡子(Fructusarctii)性味辛、苦、寒，歸胃經，對于治療咳嗽痰多，咽喉腫痛，痄腮丹毒，癰腫瘡毒有顯著效果。咽炎患者血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、C反應蛋白水平(CRP)明顯高于正常情況，且三者水平均與疾病嚴重程度呈明顯正相關，均可作為咽喉癥狀早期預測的參考性指標[3-4]。為進一步開發以該配伍為主要原料的清咽功能保健食品，設計此試驗探究其對致炎鼠消炎程度的影響，并結合ELISA技術探究該配伍對棉球致炎大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠，體質量(185±15)g，10周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號：SCXK(京)2019-0008)；SPF級BALB/c雌雄性小鼠，體質量(20±2)g，6周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號：SCXK(京)2019-0008)。實驗動物飼養于北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心SPF級動物室(許可證號：SYXK(京)2017-0038)。維持飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號：SCXK(京)2019-0008)生產。分籠飼養，控制室溫(25±2)℃，自由攝食、飲水。各劑量組均給予維持飼料。

1.2 試驗藥物藤茶(批號：20180620，購自貴州江口梵凈山云峰野生植物開發有限公司)；牛蒡子(批號：171101，購自安國市深豪藥業有限公司)；藤茶牛蒡子濃縮液：取混合樣品105.0 g(藤茶63.0 g，牛蒡子42.0 g)，常壓、溫度80℃，加1 050 mL無菌水浸泡30 min，提取2次，將提取液合并濃縮至70 mL，以下簡稱“受試物”。

1.3 主要試劑與儀器乙醚(批號：20180119，國藥集團化學試劑北京有限公司)；碘伏(批號：15111，山東利爾康牌醫療科技股份有限公司)；致炎劑1%葡聚糖4萬(批號：17027002，北京拜耳迪生物技術有限公司)；二甲苯(批號：20190118，國藥集團化學試劑北京有限公司)；大鼠TNF-α 酶聯免疫(ELISA)試劑盒(批號：202009，賽默飛世爾科技公司)；大鼠IL-6 ELISA試劑盒(批號：202009，賽默飛世爾科技公司)；大鼠CRP ELISA試劑盒(批號：202009，賽默飛世爾科技公司)；BS223S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；T1000電子天平(常熟衡器工業公司)；XR-YLS-25A電動耳腫打孔器(上海欣軟信息科技有限公司)；足趾容積測量儀(成都泰盟軟件有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)；微量加樣器(哈美頓實驗器材有限公司)。

1.4 試驗分組與處理將96只SPF級SD雄性大鼠隨機平均分成4組，以生藥計分別設定空白對照組、受試物低劑量組(0.38 g/kg)、受試物中劑量組(0.75 g/kg)、受試物高劑量組(2.25 g/kg)，用于棉球植入試驗及足趾腫脹試驗。將60只SPF級BALB/c雄性小鼠隨機平均分成4組，分別設定空白對照組、受試物低劑量組(0.75 g/kg)、受試物中劑量組(1.50 g/kg)、受試物高劑量組(4.50 g/kg)，用于小鼠耳廓腫脹試驗。

1.5 測定指標及方法

1.5.1大鼠棉球植入肉芽腫凈質量的測定 經口給予大鼠受試物36 d，試驗結束前8 d，用脫毛器脫去大鼠兩側腹股溝處的毛，乙醚麻醉大鼠，碘伏消毒，在無菌條件下切開大鼠兩側腹股溝皮膚，植入經高壓滅菌并烘干、稱質量的棉球，縫合切口，繼續給予受試物。試驗結束當天，給受試物1 h后，斷頸處死大鼠，在原縫合處剪開皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，置于已稱質量潔凈平皿中，恒溫干燥箱60℃開蓋干燥1 h后稱質量，計算肉芽腫凈質量。

1.5.2大鼠足趾腫脹率的測定 經口給予大鼠受試物36 d，試驗結束當天給1次受試樣品，1 h后，用足趾容積測量儀測量各組大鼠右后足趾的容積，作為0 h足趾容積。然后在大鼠右后足趾皮下注入等量1%葡聚糖4萬，分別于1，2，4，6 h測量大鼠足趾的容積，同一部位測量3次，取平均值。以不同時間所測足趾容積與致炎劑作用前的足趾容積之差為腫脹值，計算各個時間段的足趾腫脹率。

1.5.3小鼠耳廓腫脹率的測定 經口給予小鼠受試物36 d，試驗結束當天，汲取二甲苯20 μL，滴加在小鼠右耳外側面耳廓的中央，讓其自由擴散，30 min 后，將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用9 mm直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱質量，以兩耳質量之差為耳廓腫脹值，計算耳廓腫脹率。

1.5.4大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP的測定 斷頸處死末次給藥棉球植入大鼠前，自大鼠眼底靜脈叢取血，分離血清，低溫冰箱冷凍保存。冷凍血清室溫下融化，測定方法參照賽默飛世爾科技公司相應ELISA試劑盒操作說明。

1.6 急性經口毒性試驗小鼠20只，雌雄各半，試驗前禁食4 h，自由飲水。試驗期間，動物自由攝食和飲水，末次灌胃后繼續禁食2 h。小鼠灌胃受試物1次，灌胃劑量為30 g/kg (以生藥計)。連續觀察14 d，觀察并記錄動物的一般狀態、體質量變化、中毒體征以及死亡情況等。

2 結果

2.1 對受試動物一般狀態和體質量的影響受試動物精神狀態、行為活動、攝食攝水等均未見明顯異常。給予受試物前后，大、小鼠的體質量在各劑量組與空白對照組間比較差異均無顯著性。

2.2 受試物對大鼠棉球植入肉芽腫凈量的影響由表1可見，經口給予大鼠受試物36 d后，與空白對照組比較，中劑量組和高劑量組大鼠肉芽腫凈量降低，其中中劑量組具有顯著性差異(P<0.05)，高劑量組具有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 大鼠棉球植入試驗肉芽腫凈量

2.3 受試物對棉球植入大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量的影響經口給予大鼠不同劑量受試物36 d后，與空白對照組比較，中、高劑量組TNF-α含量明顯降低，高劑量組的IL-6含量降低，有極顯著性差異(P<0.01)。與空白對照組比較，各劑量組血清CRP含量均顯著性降低，且有極顯著性差異(P<0.01)，大鼠的CRP水平受樣品的影響呈現負相關性。

表2 大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP含量水平 ng/L

2.4 受試物對大鼠足趾腫脹率的影響由表3及圖1可見，經口給予大鼠受試物36 d后，與空白對照組比較，各劑量組大鼠注射致炎劑后不同檢測時間均可見足趾容積降低，且各劑量組部分時間差異具有顯著性。其中高劑量組注射致炎劑1%葡聚糖4萬后4 h內足趾腫脹率顯著降低，有極顯著性差異(P<0.01)。低、中劑量組注射致炎劑1%葡聚糖4萬后2 h內大鼠足趾腫脹率具有顯著性差異(P<0.05)。各劑量受試組均能降低注射致炎劑1%葡聚糖4萬導致的足趾腫脹率，注射后6 h達到與空白大鼠足趾腫脹率一致。

表3 注射致炎劑1%葡聚糖4萬后1～6 h大鼠足趾腫脹率

2.5 受試物對小鼠耳廓腫脹率的影響由表4及圖2可見，經口給予小鼠受試物36 d后，各劑量組小鼠耳廓腫脹率與空白對照組比較均有降低，且差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)。

2.6 急性經口毒性試驗在觀察期14 d內，動物狀態正常，無中毒體征和死亡等異常情況，15 d小鼠大體解剖檢查，主要臟器未見明顯異常。所有小鼠經口急性耐受劑量均大于30 g/kg，按急性毒性分級標準[7]評價，該受試樣品屬實際無毒。

圖1 注射致炎劑1%葡聚糖4萬后1～6 h大鼠足趾腫脹率

表4 小鼠耳腫脹試驗耳廓腫脹率

圖2 小鼠耳廓腫脹試驗耳廓腫脹率

3 討論

咽炎屬于中醫學“喉痹”范疇，最早見于《皇帝內經》，其中《素問·陰陽別論》“一陰一陽結，謂之喉痹”，以“虛火喉痹”居多[5-6]。隨著城市的快速發展，大中型城市的空氣污染問題日益嚴重，霧霾等極端天氣首當攻擊人體的呼吸系統。本試驗研究藤茶及牛蒡子配伍對動物清咽功能的影響，其主要成分藤茶分布較廣，適應性強，資源豐富，主要產自我國湖北、湖南、貴州、福建、江西等山區[7-8]。它具有較強的抗氧化作用，有清熱解毒、利咽護嗓、保肝護肝、降血脂、降血糖、抗菌消炎、解酒毒、活血化瘀、抗病毒、抗腫瘤，以及免疫增強等功效[9]。牛蒡子中主要含有牛蒡子苷、牛蒡子苷元、羅漢松脂素、牛蒡酚A～H等木脂素類成分和揮發油及油脂類成分[10]。現代藥理學研究證明，牛蒡子具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎、抗病毒、抗菌等作用[11]。牛蒡子為清咽保健食品常用中藥，筆者運用中醫藥配伍理論，結合對藤茶和牛蒡子清咽作用機制的報道進行分析，藤茶與牛蒡子配伍應用能夠緩解咽部不適。

本研究中，經口給予大鼠本藤茶牛蒡子配伍樣品36 d后，高劑量組大鼠肉芽腫凈重及其血清中TNF-α、IL-6、CRP水平，以及1～4 h足趾腫脹率顯著低于空白對照組。高劑量組小鼠耳腫脹率均顯著低于空白對照組。該樣品對大、小鼠體質量增長均無不良影響，小鼠經口急性耐受劑量均大于30 g/kg,該受試品屬于實際無毒。

綜上試驗結果表明，該藤茶及牛蒡子配伍樣品在動物致炎模型中發揮了消炎作用，能有效降低致炎大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP水平，共同協同達到清咽的目的，各組動物臟器均未見明顯病變，可為臨床兩者配伍治療咽喉癥狀提供試驗依據。