子宮內膜炎奶牛血酮與炎性細胞因子的相關性

張瑞雪， 張 博， 趙 輝， 趙 謎， 郭延生

(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021)

子宮內膜炎是奶牛養殖業中最常見的產后疾病，易引起產奶量和繁殖力下降。引發奶牛子宮內膜炎最普遍因素是細菌感染[1-2]，這些細菌包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌等。當大量細菌入侵奶牛子宮時，抗原刺激免疫細胞(B細胞、T細胞、單核細胞、自然殺傷細胞等)和非免疫細胞(表皮細胞、血管內皮細胞等)合成并分泌細胞因子，從而激活局部非特異性和特異性的細胞、體液免疫機制，清除子宮內感染的細菌等有害物質。但奶牛產后干物質采食量下降，能量輸出增加，易導致能量負平衡，奶牛免疫力減弱，引起子宮內膜炎的發生。研究表明，奶牛臨床或亞臨床子宮內膜炎的發生與子宮組織中炎性細胞因子mRNA的表達有極大的關聯[3-4]，子宮內膜炎奶牛血清中大多數炎性細胞因子表達水平顯著升高[5-6]。為更全面評價炎性細胞因子在奶牛子宮內膜炎炎癥中的變化規律及其與能量負平衡之間相關性，本研究對產后子宮內膜炎奶牛血酮與血漿中炎性細胞因子的變化及其相關性進行研究，以期為子宮內膜炎的診斷和治療提供更詳細的資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、生長轉化因子-β(TGF-β)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-13(IL-13)、白細胞介素-17(IL-17)、白細胞介素-18(IL-18)、白細胞介素-23(IL-23)檢測試劑盒，均購自江蘇晶美生物科技有限公司；Nova Vet血酮(BHBA)檢測試紙(哈羅德，中國)。

1.2 實驗動物的選擇與樣品制備本試驗中實驗動物均為荷斯坦奶牛。從寧夏賀蘭中地生態牧場一場隨機選取8頭2～3胎次產后0～21 d患有子宮內膜炎奶牛和8頭2～3胎次產后0～21 d健康奶牛,尾靜脈采血，裝入抗凝管，制備血漿，—80℃保存。

1.3 血液中細胞因子的測定采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定血漿中促炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、IL-23和抗炎性細胞因子TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13的質量濃度,所有試驗步驟均按照試劑盒所帶說明書中的方法進行。

1.4 血酮值的測定用血酮檢測試紙測量血酮值(KET,ketone bodies)，并記錄。

2 結果

2.1 子宮內膜炎奶牛血漿中促炎性細胞因子的變化規律ELISA檢測子宮內膜炎奶牛和健康奶牛血漿中促炎性細胞因子的表達量，結果顯示，子宮內膜炎組血漿中促炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-17和IL-18的含量顯著升高(P<0.05)，而IL-23的含量無明顯變化(P>0.05)(表1)。

表1 子宮內膜炎組和對照組血漿中促炎性細胞因子測定結果 ng/L

2.2 子宮內膜炎奶牛血漿中抗炎性細胞因子的變化規律ELISA檢測子宮內膜炎奶牛和健康奶牛血漿中促炎性細胞因子的表達量,結果顯示，子宮內膜炎組血漿中抗炎性細胞因子TGF-β、IL-4和IL-10的含量與對照組相比明顯升高(P<0.05)，而IL-13的含量無明顯變化(P>0.05)(表2)。

表2 子宮內膜炎組和對照組血漿中促炎性細胞因子測定結果 ng/L

2.3 奶牛產后炎性細胞因子和酮體相關性分析

2.3.1奶牛產后試驗組和對照組血酮值變化 圖1中四分位數為箱型方框的上、下邊，以最大值(max)、最小值(min)為線的上、下端，箱型方框中的線為中位數(median)的位置。子宮內膜炎組奶牛的最大血酮值(mmol/L)約為3.5,上四分位數約為2.8,中位數約為1.5，下四分位數約為1.1,最小血酮值約為0.5(對照組);而對照組的最大血酮值(mmol/L)約為1.5,上四分位數約為1.2,中位數約為0.8,下四分位數約為0.5,最小血酮值約為0.2(子宮內膜炎組);說明子宮內膜炎組奶牛的血酮值顯著升高(P<0.05)。

2.3.2炎性細胞因子和酮體相關性分析 子宮內膜炎奶牛KET與促炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-8、IL-18的相關系數分別為0.786，0.833，0.810，0.881，與抗炎性細胞因子TGF-β、IL-4、IL-10的相關系數分別為0.738，0.738，0.714。KET與TNF-α、IL-1、IL-8水平之間呈顯著性正相關(P<0.05)，與IL-18水平之間呈極顯著性正相關(P<0.01)，KET與TGF-β、IL-4、IL-10水平之間呈顯著性正相關(P<0.05)(表3)。

注：**代表極顯著性差異(P<0.01)

3 討論

3.1 子宮內膜炎奶牛促炎性細胞因子含量變化奶牛子宮在正常情況下受生理屏障和防御機能的保護，處于無菌健康狀態。即使有細菌入侵，子宮會逐漸將其凈化，在一定的時間內復舊。奶牛分娩后，子宮頸擴張，細菌易通過外陰、生殖道和開張的子宮頸入侵子宮，而且奶牛產后初期子宮內的環境和溫度有利于細菌的繁殖，產后初期奶牛子宮內都會產生一定程度的炎癥。但是，奶牛的子宮復舊機能能夠在產后21 d之內，清除子宮內感染的細菌等有害物，使其恢復健康狀態。然而，體質差、免疫機能弱的奶牛，細菌在其體內大量繁殖，造成子宮內膜損傷，引發子宮內膜炎等疾病。子宮內膜炎的發病率高達20%～40%[7]。造成子宮內膜炎的可能原因是奶牛分娩后初期泌乳增加、干物質采食量不足等，導致奶牛的免疫力下降，大量的細菌入侵子宮并繁殖。

本試驗結果發現，子宮內膜炎奶牛血漿中TNF-α的表達水平明顯升高。TNF-α是一種可以誘導多種細胞分泌的致炎因子，是奶牛子宮內膜炎的診斷標志物之一[8]。TNF-α能增強單核吞噬細胞、T細胞和成纖維細胞等各種細胞中IL-6合成而具有繼發性炎癥作用，并且可能調節免疫、炎性或修復性反應[8]。另外，當TNF-α的表達量過高時，可直接作用于子宮內膜上皮細胞，使內皮細胞受損，導致子宮產生炎癥反應[9]。

同時，高水平的TNF-α能夠增加細胞毒性，誘導IL-1、IL-6、IL-8的產生，加重奶牛子宮內膜炎炎癥[10]。本試驗結果發現，子宮內膜炎組血漿中IL-1、IL-6、IL-8的質量濃度顯著升高。有相關研究發現，子宮內膜炎奶牛血清中IL-1的表達水平顯著升高[10]，IL-6[11]和IL-8[9]的表達水平也有升高趨勢。IL-1質量濃度增加，可能由于奶牛子宮炎癥持續的過程中，抗原刺激巨噬細胞分泌大量的IL-1，誘導IL-6、IL-8、TNF-α和趨化因子表達，以達到促進炎癥反應的作用。作為中性粒細胞的趨化劑，高質量濃度的IL-8能夠趨化嗜中性粒細胞及炎性細胞等向病灶部位游走、積聚，以清除炎癥部位的細菌、壞死組織和損傷的細胞，從而促進奶牛子宮內膜炎炎癥的發展，增強和放大炎癥反應，引起機體局部免疫反應[2]。

本試驗結果發現，子宮內膜炎奶牛組血漿中IL-6的質量濃度顯著高于對照組。有研究證實奶牛子宮內膜炎通常會導致TNF-α和IL-6等促炎性細胞因子含量增加[9]。IL-6 mRNA的表達不受子宮炎癥的影響[12]，當奶牛受到病毒或其他一些促炎因子(IL-1、TNF-α)的刺激時，局部免疫系統的細胞才會產生IL-6[13]。高質量濃度的IL-6能夠促進B細胞分化為漿細胞，導致機體產生更多的抗體。子宮內膜炎奶牛的子宮中存在病原微生物，將會導致白細胞(主要是中性粒細胞)數量增加[14]。本試驗中子宮內膜炎奶牛血液中促炎性細胞因子IL-6水平升高。然而，有相關研究表明，血清中IL-6含量在子宮內膜炎奶牛和健康奶牛之間沒有差異性[15]，推測是病原微生物刺激子宮產生的白細胞和隨血液一起流入的白細胞分泌IL-6，導致子宮沖洗液中IL-6質量濃度顯著性升高。

目前，國內外關于IL-17的研究集中在皮癬、炎性關節炎、牛皮癬關節炎的治療方面[16]，尚未發現奶牛子宮內膜炎方面的相關報道。本試驗結果表明，子宮內膜炎組血漿中IL-17的質量濃度顯著升高。有研究發現，患有慢性子宮內膜炎的人，IL-17質量濃度明顯升高[17]。同時，乳腺炎奶牛IL-17的表達量也顯著性升高[18]。IL-17過度表達，會導致細胞中趨化因子的產生和白細胞浸潤[19]，介導奶牛子宮內膜炎的炎癥反應。

3.2 子宮內膜炎奶牛抗炎性細胞因子含量變化研究發現，子宮內膜炎奶牛的血清中IL-10的表達水平有顯著升高趨勢，子宮內膜異位癥婦女的血清中TGF-β、IL-10表達水平顯著升高[10,20]，同時，豬子宮內膜炎中IL-4、IL-10表達量顯著升高[21]。本試驗結果顯示，子宮內膜炎奶牛血漿中抗炎性細胞因子IL-4、IL-10、IL-13和TGF-β的質量濃度顯著升高。CD8+淋巴細胞釋放增加，在奶牛子宮內膜炎炎癥持續的過程中，發揮其抑制功能，抑制炎癥反應[13]。本研究中IL-10表達水平升高可能與CD8+淋巴細胞釋放增加相關。高質量濃度的IL-10通過抑制T細胞的增殖使局部細胞的免疫能力下降，抑制免疫效應細胞對子宮內膜組織的保護作用，此時，子宮局部抵抗細菌等感染的能力減弱，微生物無法被完全清除而損壞奶牛子宮內膜組織，從而使奶牛子宮內膜炎持續存在。目前，IL-4和IL-13在動物子宮內膜炎等方面的研究還未見報道。本試驗IL-4和IL-13表達水平升高，其可能原因是細菌等病原微生物入侵子宮，造成局部感染，體液免疫和細胞免疫被激活，而T輔助細胞(TH)的活化和增殖是特異性免疫產生的關鍵，活化的TH細胞分泌大量IL-4和IL-13。高質量濃度的TGF-β可能通過誘導免疫球蛋白IgA分泌并促進組織修復來發揮抗炎作用。

本試驗結果表明，子宮內膜炎奶牛血漿中IL-13、IL-18和IL-23的質量濃度與對照組無顯著性差異。已知IL-13是一種多功能的Th2型細胞因子，它可以減輕炎癥反應，但其與奶牛子宮內膜炎的相關性有待研究。國內外關于IL-13的報道發現，IL-13能夠增強病灶周圍區域受損神經元的小膠質細胞和巨噬細胞的吞噬作用，以改善神經炎癥和促進腦功能的恢復[22]。奶牛被分枝桿菌感染時，促炎性細胞因子IL-18水平顯著升高，導致免疫反應增強[23]。國內外關于細胞因子IL-23的最新研究，都體現在其對包括關節炎在內的炎性疾病進展的影響，通常與T淋巴細胞的生物學有關[24]。

3.3 子宮內膜炎奶牛炎性細胞因子與酮體相關性分析圍產期奶牛由于飼糧、管理和環境等改變，能量需要和生產需求增加，干物質采食量下降，導致奶牛能量負平衡(negative energy balance,NEB)。奶牛產后子宮易受微生物感染，引發子宮炎癥。長期NEB導致奶牛產生大量酮體，引起酮病，使奶牛體質下降和子宮的免疫力減弱而引起子宮復舊機能顯著下降[25]。有研究發現，NEB與奶牛產后疾病具有很大的相關性，NEB使臨床型子宮內膜炎發病率顯著增加[26]。本研究中，子宮內膜炎組奶牛的血酮值顯著升高，KET與TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-4、IL-8、IL-10水平之間呈顯著性正相關，與IL-18水平之間呈極顯著性正相關，表明奶牛產后能量負平衡能顯著降低奶牛的免疫水平，進而誘發子宮內膜炎的發生。

本研究采用Nova Vet血酮儀和ELISA法對子宮內膜炎奶牛血液中的KET與炎性細胞因子進行了測定和相關性分析，結果顯示子宮內膜炎奶牛KET、TNF-α、TGF-β、IgG、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17及IL-18的水平顯著升高，KET與TNF-α、IL-1、IL-8、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-18之間呈顯著性或極顯著性正相關，說明奶牛產后能量負平衡可顯著降低其免疫水平，是子宮內膜炎發生的因素之一。