抗蓖麻毒素精制免疫球蛋白的制備及免疫防治效果評價

楊曉嵐，李 敏，谷宏婧，李欣昱，段躍強，范鐵炯，李 鑫，楊鵬輝，劉國鳳，劉 媛，閆 芳，賀 威，趙忠鵬*

(1.軍事科學院 軍事醫學研究院 微生物流行病研究所 感染免疫與防治研究室,北京 100071；2.上海賽倫生物技術有限公司，上海201418；3.解放軍總醫院 第五醫學中心，北京 100039；4.青島市婦女兒童醫院，山東 青島 266034；5.山西農業大學 動物科技學院，山西 太谷 030800；6.安徽醫科大學 基礎醫學院,安徽 合肥 230032)

蓖麻毒素是最為重要的毒素類生物戰劑，易獲得、易提取、易使用、難監管，已列入1972年的生物武器公約及1997年的化學武器公約中[1]。自美國“911”恐怖襲擊和炭疽襲擊事件以來，特別是蓖麻毒素驚現倫敦后，蓖麻毒素正式被美歐列為最有可能被用作恐怖襲擊的生物戰劑，引起了世界各國的高度重視[2]。早在2002年，美國政府就提出:“蓖麻毒素防治藥物是生物毒素戰劑醫學防護的重要研究方向”，每年都投入大量資金資助蓖麻毒素醫學防護領域的研究，重點集中在中毒治療性藥物和預防性疫苗，已取得了一定進展[3]。而我國在救治藥物、預防疫苗研究方面還存有大量空白，研制安全、有效的防治藥物勢在必行[4]。

鑒于人類與中毒病斗爭的經驗，最有效、最經濟的手段是抗血清的免疫防治。雖然抗體研究和使用歷經百年，多次迭代，但是現今市場上仍流通著不同時代的產品，他們相互補充，無法完全取代[5]。尤其是馬抗血清制品的安全性、有效性、穩定性在多個產品上已獲證實，針對不同的抗血清產品僅是更換了相應的免疫抗原，對制品的質量標準及安全性并無影響，是最便捷、最經濟的抗體研發技術平臺，應得到充分利用[6]。

1 材料與方法

1.1 蓖麻毒素純品的制備及檢定稱取500 g去殼蓖麻籽，在5 mmol/L磷酸緩沖液中勻漿，用4層紗布濾去殘渣，于4℃ 20 000×g離心30 min，取上清,加入固體(NH4)2SO4達到60%飽和度，置4℃ 3 h;20 000×g離心30 min，把沉淀溶解在適量緩沖液中，4℃透析24 h;4℃ 20 000×g離心10 min，上清液即為粗品。用4-氨苯基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷衍生化的瓊脂糖作為親和介質，用半乳糖洗脫以除去粗品中的雜蛋白；根據蓖麻毒素與凝集素對離子交換樹脂的結合能力不同，將凝集素與蓖麻毒素分離，最終得到純品。將純品進行SDS-PAGE和HPLC純度檢定，并用小鼠測定半數致死量(LD50)值。

1.2 蓖麻毒素脫毒將蓖麻毒素純品按甲醛1∶1 000 ～1∶8 000進行脫毒，室溫條件下分別放置48，72，96，120，144 h，進行透析袋濃縮、生理鹽水平衡、0.22 μm濾膜除菌試驗，Lowry法測蛋白含量并適量稀釋后，接種小鼠，每只接種0.5 mL，觀察1周，通過BALB/c小鼠存活情況，觀察脫毒效果。

1.3 實驗動物和細胞體質健康蒙古馬，4～6歲，10匹，經檢疫符合現行《中國藥典》要求。SPF級BALB/c小鼠，6～8 周齡，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司;Vero細胞，由軍事醫學研究院微生物流行病研究所細胞庫提供。

1.4 馬抗蓖麻毒素原料血漿的制備將純化脫毒蓖麻毒素抗原(1∶1)與等體積的弗氏不完全佐劑混合，乳化，經馬匹頜下、腹股溝淋巴結多點注射免疫，前4次基礎免疫劑量分別為4,4,5,6 mg，每次間隔21 d，末次免疫后14 d， MTT法測定血清效價不低于1∶64 000時，采血，分離血清。

1.6 MTT法測定蓖麻毒素精制免疫球蛋白對蓖麻毒素的中和效果將Vero細胞接種于96孔板，每孔100 μL，含細胞2×104個/孔，37℃培養24 h，細胞長成單層。用DMEM培養基對蓖麻毒素精制免疫球蛋白(中和抗體活性10 000 U/mL)倍比稀釋，起始稀釋度為1∶4 000，共8梯度，而后用無血清DMEM培養液稀釋蓖麻毒素(起始質量濃度0.75 g/L)，再加入等量的蓖麻毒素液(含100 TCID50)，37℃共孵育1 h，然后200 μL/孔依次加入預先吸出上清液的細胞孔，每個稀釋度設4個復孔，并設正常細胞對照(不加毒素不加蓖麻毒素精制免疫球蛋白)、蓖麻毒素對照(加毒素不加蓖麻毒素精制免疫球蛋白)、正常馬免疫球蛋白對照(加毒素加正常馬免疫球蛋白)。每天觀察，當蓖麻毒素對照孔細胞病變時，加MTT(0.5 g/L)200 μL/孔染色4 h，吸去液體加終止液(10%SDS+0.01 mol/L HCl)200 μL/孔溶解8 h，測定D570值。

1.7 動物法測定蓖麻毒素精制免疫球蛋白對蓖麻毒素的中和效果選用BALB/c小鼠30只，分6組，5只/組。用0.01 mol/L PBS對蓖麻毒素稀釋5個梯度，分別為10,50,100,500,1 000 LD50，每個梯度的終體積為0.2 mL；用0.01 mol/L PBS將蓖麻毒素精制免疫球蛋白稀釋4倍，按終體積0.2 mL/梯度，分別加入不同稀釋度的蓖麻毒素，37℃溫箱孵育1 h，同時設正常馬免疫球蛋白對照組。將中和后的混合液腹腔注射BALB/c小鼠0.4 mL/只，每天觀察小鼠死亡情況，連續觀察72 h并記錄結果。以在BALB/c小鼠體內中和1 LD50蓖麻毒素所需用精制免疫球蛋白的量為1個用藥單位(U)，標示精制免疫球蛋白含量。

1.8 蓖麻毒素精制免疫球蛋白制品在動物體內有效性研究

1.8.1測定蓖麻毒素對小鼠的LD50小鼠30只，5只/組，共6組。腹腔注射蓖麻毒素量分別為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12 μg，每只注射劑量為0.2 mL。每天觀察并記錄小鼠存活數，根據Reed-Munch公式計算LD50值。

1.8.2小鼠體內預防試驗 選用小鼠25只，分5組，5只/組，稱體質量。用0.01 mol/L PBS 1∶400稀釋制品，每只小鼠靜脈注射0.2 mL，對照組每只小鼠注射同等量的0.01 mol/L PBS 0.2 mL。分別于注射免疫球蛋白后3,4,5,6 d腹腔注射0.01 mol/L PBS稀釋的蓖麻毒素5 LD50，每天稱小鼠體質量，并記錄死亡情況。

1.8.3小鼠體內治療試驗 選用小鼠25只，分5組，5只/組，稱體質量。用0.01 mol/L PBS稀釋蓖麻毒素，每只小鼠腹腔注射5 LD50/0.2 mL建立感染動物模型。分別于注射蓖麻毒素后2，3，4，5 h靜脈注射0.01 mol/L PBS 稀釋的免疫球蛋白25 U/0.2 mL，每天稱小鼠體質量，并記錄死亡情況。

1.9 安全性檢測按照現行《中國藥典》要求，對制品進行無菌試驗、熱原檢查、異常毒性試驗、一般藥理試驗、急性毒性試驗、免疫毒性試驗、溶血和血管刺激性試驗。

2 結果

2.1 蓖麻毒素純品的制備及檢定對制備的蓖麻毒素純品進行檢測，檢測結果顯示，經初步優化后，純化的蓖麻毒素純度均在90%以上，腹腔注射對小鼠LD50值約為6.38 μg/kg(圖1)。

A.蓖麻毒素 SDS-PAGE代表性結果(M.蛋白Marker；1.親和層析洗脫液；2.離子交換層析穿過液；3.洗脫液);B.蓖麻毒素 HPLC檢測

2.2 蓖麻毒素純品的脫毒及驗證經常規毒素脫毒試驗驗證(表1)，甲醛濃度為1∶4 000，室溫脫毒96 h，蓖麻毒素被完全脫毒。

表1 不同甲醛濃度脫毒蓖麻毒素純品效果

A.蓖麻毒素精制免疫球蛋白SDS-PAGE結果(M.蛋白Marker；1.血漿;2.S/D滅活血漿;3.蓖麻毒素精制免疫球蛋白)；B.蓖麻毒素精制免疫球蛋白HPLC結果

2.4 MTT法測定蓖麻毒素精制免疫球蛋白效價MTT法測得正常馬血清免疫球蛋白對蓖麻毒素沒有中和效果，蓖麻毒素精制免疫球蛋白對蓖麻毒素的抗體效價為1∶128 000，說明研制的蓖麻毒素精制免疫球蛋白具有很好的中和抗體活性(表2)。

表2 MTT法測定蓖麻毒素精制免疫球蛋白對蓖麻毒素中和效果 D570值

2.5 動物法測定蓖麻毒素精制免疫球蛋白對蓖麻毒素的中和抗體效價動物法測定蓖麻毒素精制免疫球蛋白可完全中和500 LD50蓖麻毒素，小鼠健康存活，而正常馬免疫球蛋白對照組小鼠48 h內全部死亡，中和抗體效價超過6 000 U/mL(表3)。

表3 蓖麻毒素精制免疫球蛋白在小鼠體內的中和抗體效價(存活數比例,n=5)

2.6 蓖麻毒素精制免疫球蛋白在小鼠體內的防治效果當小鼠腹腔注射用量為1 250 U/kg蓖麻毒素精制免疫球蛋白時，分別于3，4，5 d注射5 LD50蓖麻毒素后，給藥小鼠均未見死亡，并且7 d 后體質量均可恢復至給藥前水平；而給藥后6 d 注射蓖麻毒素的小鼠，于注射毒素72 h內全部死亡；對照組在注射蓖麻毒素后48 h內全部死亡(表4)。

表4 蓖麻毒素精制免疫球蛋白在小鼠體內的預防效果(n=5)

當腹腔注射5 LD50蓖麻毒素感染小鼠發病后，分別在2，3，4 h靜脈注射蓖麻毒素精制免疫球蛋白，發病的小鼠全部存活，給藥后體質量雖有下降，但7 d小鼠體質量均恢復至注射毒素前水平；當5 h 后給予蓖麻毒素精制免疫球蛋白小鼠于144 h 內全部死亡，而沒有給予蓖麻毒素精制免疫球蛋白的對照組小鼠48 h內也全部死亡(表5)。

表5 蓖麻毒素精制免疫球蛋白在小鼠體內的治療效果(n=5)

2.7 蓖麻毒素精制免疫球蛋白的安全性按照現行《中國藥典》要求，委托北京昭衍新藥研究中心，開展無菌試驗、熱原檢查、異常毒性試驗、一般藥理試驗、急性毒性試驗、免疫毒性試驗、溶血和血管刺激性試驗，試驗結果均符合現行《中國藥典》要求，具有良好的安全性。

3 討論

蓖麻毒素作為最有可能被用作恐怖襲擊的生物戰劑，防治藥物研究是醫學防護的重中之重。蓖麻毒素預防性疫苗在美國已經完成Ⅰ期臨床試驗，具有一定的安全性和有效性，在我國還未見報道[8]；蓖麻毒素中和性單抗國內外均有報道，可在緊急條件下有條件批準使用，其難于生產、價格貴，限制了其臨床應用[9]。

抗體研發最核心的環節之一是免疫原的制備。由于功能性蓖麻毒素的工程性表達難度大、成本高[10]，故本研究選擇從蓖麻籽中提取，原料充足、成本低廉，在借鑒其他團隊成功提取蓖麻毒素粗品經驗的基礎上，根據蓖麻毒素的性質，增加了親和層析和離子交換層析方法，獲得了純度90%以上的純品，為免疫動物用抗原提供了物質基礎，也為動物模型建立提供了高品質的毒素。蓖麻毒素脫毒是制備免疫用抗原較為重要的環節，脫毒不足，會造成馬匹的死亡；脫毒過量，會造成免疫馬匹中和效價降低，導致最終制品雜質多、品質差，在不斷摸索中，課題組找到了最佳的滅活條件。

抗體研發最關鍵的環節之一是治療性抗體的評價。本研究建立了蓖麻毒素中毒細胞模型和動物模型。在2個模型中，均證明制品的有效性，為臨床試驗奠定了藥理學基礎，也為藥效學評價中細胞替代動物研究奠定基礎。遵從動物倫理學的要求，在制品批簽發時，盡量用細胞模型測定制品的抗體效價，以減少實驗動物的使用量[11]。

總之，利用現代生物制藥技術，本試驗成功制備蓖麻毒素精制免疫球蛋白，有望成為蓖麻毒素中毒的“救命藥”，正在加緊進行臨床研究，以爭取早日上市，為中毒患者服務。