淺綠色氣球菌噬菌體vB_AviM_AVP編碼蛋白的表達純化和功能分析

張 昊，襲恒豫，畢斕婷，趙日虹，冀亞路，王心舞，王子晶，顧敬敏，韓文瑜

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

淺綠色氣球菌 (Aeroeoccusviridans)是過氧化氫酶和氧化酶陰性、微需氧性和非運動性細菌，一種革蘭陽性球菌[1]，廣泛分布在環境中，由于其形態與鏈球菌很相似且常引起混合感染，故二者常混淆[2]。淺綠色氣球菌雖然不是一種常見的病原菌，但卻是潛在的機會病原菌，當機體免疫力下降或免疫功能不健全時，可以引起人類心內膜炎、敗血癥、菌血癥以及關節炎等[3]；在獸醫臨床上，可引起豬的腦膜炎、肺炎、尿路感染和關節炎，牛臨床和亞臨床乳腺炎等。目前，治療由淺綠色氣球菌引起的感染仍以抗生素為主。但近期研究表明，新分離的淺綠色氣球菌具有多重耐藥性[4]，尋找新的治療方法已經迫在眉睫。

噬菌體是一種能夠特異性識別、感染和復制宿主細菌的細菌病毒[5-6]，由于其具有特定的殺菌能力，在20世紀20年代早期，噬菌體一直被認為是治療性的藥物[7]。然而，由于抗生素的廣泛應用，這種治療方法被擱淺[8]。近年來，由于多重耐藥細菌在全球多地廣泛出現，以噬菌體為治療的方法得到了廣泛關注，裂解酶的應用也得到了推廣。本研究根據已經報道的淺綠色氣球菌噬菌體vB_AviM_AVP的基因組[9]，對LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98進行原核表達與純化，并對其活性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒淺綠色氣球菌AV-X1、N14-1，金黃色葡萄球菌R196、鏈球菌SS42、 Pet-15b由吉林大學動物醫學學院微生物學與免疫學實驗室保存；大腸桿菌DH5α、BL21感受態購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑BHI培養基、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)；XhoⅠ、BamHⅠ(TaKaRa)；T4DNA連接酶(NEB)；氨芐青霉素、咪唑、IPTG(Sigma)；Tris-base、SDS、甘氨酸、過硫酸銨(Amresco)；Ni-NTA(GE)、蛋白Marker(Thermo)；超濾管(Millipore)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)。

1.3 引物引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 引物信息

1.4 裂解酶載體的構建及蛋白表達與純化

1.4.1載體的構建 以vB_AviM_AVP的基因組作為模板，用表1的引物通過PCR獲得目的基因；選取適當的限制性內切酶對目的基因和載體進行雙酶切；將酶切后的載體和目的片段按照1∶5的比例混合連接，先轉化至DH5α感受態細胞中，然后轉化至BL21感受態細胞中。

1.4.2誘導與表達 挑取Amp+平板上的單菌落培養10 h，轉接入500 mL LB培養基中，按照1%的比例加入Amp+進行大量擴增。當菌液生長到對數期時(D600= 0.6～0.8)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16℃低溫誘導16 h。4℃、8 000 r/min離心10 min后棄上清，用50 mL Tris-NaCl溶液將菌體重懸。

1.4.3純化 將收集的菌體置于冰上，超聲30 min，破碎菌體。4℃、12 000 r/min離心20 min后收集上清。將超聲上清加入Ni-NTA柱子中，并將填料重懸，使得蛋白能與填料充分結合。靜置3 min 后，使上清液自然流出。用Tris-NaCl溶液將濃度為5 mol/L的咪唑分別稀釋至終濃度為20，50，500 mmol/L。其中20，50 mmol/L的咪唑各50 mL洗滌雜蛋白，500 mmol/L的咪唑10 mL洗脫目的蛋白。通過超濾管以4℃、3 500 r/min離心30 min對純化后的裂解酶進行濃縮。

1.5 LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysOR-F98的活性檢測將淺綠色氣球菌AV-X1、NP-1，金黃色葡萄球菌R196、鏈球菌SS42活化，取100 μL 的菌液涂布在平板上，分別取10 μL的超聲上清和純化后的LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98蛋白，培養過夜，觀察是否有空斑出現。

1.6 酶譜試驗用500 mL BHI 擴增淺綠色氣球菌AV-X1、金黃色葡萄球菌R196、鏈球菌SS42，擴增5 h后離心，ddH2O洗滌3次，用5 mL的ddH2O將菌體重懸后高壓，于-20℃保存備用。配置SDS-PAGE分離膠，加入高壓后的菌液，使膠呈半透明狀態。樣片加入Loading Buffer后進行跑膠，電泳結束后將膠置于復性劑中(50 mmol/L Tris,1% TristoX-100,pH 7.4)，脫色搖床慢搖2 h復性。

1.7 高碘酸鹽以及蛋白酶K處理菌體試驗先將淺綠色氣球菌AV-X1、金黃色葡萄球菌R196、鏈球菌SS42的菌液離心，棄掉上清，用無菌的PBS洗3次，加入等體積pH 5.2的50 mmol/L乙酸鈉。分為4組，對照組，直接加入蛋白(50 mg/L)組，加入100 mmol/L高碘酸 25℃避光處理2 h組，加入蛋白酶K 10 μL處理3 h組。將后2組處理后的樣品用無菌PBS洗5次，再分別加入蛋白(50 mg/L)，測30，60，90，120 min以及12 h的D600值。

1.8 混合蛋白活性檢測將淺綠色氣球菌搖至D600值為0.8左右，用無菌的PBS洗3次后，用等體積的PBS重懸，分為4組，分別為空白對照組、混合蛋白組(LysORF86、LysORF94、LysORF90、LysORF98以相同濃度混合入1 mL體系中)、混合蛋白+裂解酶組(LysORF86、LysORF94、LysORF90、LysORF98、裂解酶以相同濃度混合入1 mL體系中)、裂解酶組。測30，60，90，120 min以及12 h的D600值。

2 結果

2.1 LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysOR-F98的原核表達與純化蛋白純化結果如圖1，2，3所示，結果表明LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98均得到表達，且表達形式為可溶性，純化后分別得到了大小約為73.7，38.2，112.0，20.4 kDa蛋白。

M.蛋白Marker；1.誘導后的全菌；2.超聲后的上清;3.超聲后的沉淀;4.純化后的LysORF86;5.誘導后的全菌;6.超聲后的上清;7.超聲后的沉淀;8.純化后的LysORF94

2.3 Lys-AVP-02、Lys-AVP-05、Lys-AVP-07和Lys-AVP-08的活性檢測平板涂布滴板結果表明，LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98均沒有活性(圖4，5)。

2.4 酶譜試驗結果顯示，蛋白LysORF86對AV-X1、SS42表現出活性(圖6，7)，蛋白LysORF90對AV-X1表現出活性(圖8)，蛋白LysORF94對R196表現出活性(圖9)，蛋白LysORF98對AV-X1無活性(圖10)。

M.蛋白Marker；1.未誘導的菌液；2.誘導后的全菌；3.超聲后的上清；4.超聲后的沉淀；5.純化后的LysORF90

M.蛋白Marker;1.未誘導的菌液;2.誘導后的全菌;3.超聲后的上清;4.純化后的LysORF98

A:AV.淺綠色氣球菌AV-X1;NP-1.淺綠色氣球菌NP-1;上清.LysORF90超聲后的上清;純化.純化后的LysORF90。B：R196.金黃色葡萄球菌R196;SS42.鏈球菌SS42;上清.LysORF90超聲后的上清;純化.純化后的LysORF90

A：AV.淺綠色氣球菌AV-X1;NP-1.淺綠色氣球菌NP-1;上清.LysORF98超聲后的上清;純化.純化后的LysORF98。B：R196.金黃色葡萄球菌R196;SS42.鏈球菌SS42;上清.LysORF98超聲后的上清;純化.純化后的LysORF98

M.蛋白Marker;1.ORF86;2.ORF94

M.蛋白Marker;1.ORF80;2.ORF94

2.5 高碘酸鹽以及蛋白酶K處理菌體試驗結果顯示，蛋白LysORF86對AV-X1和SS42表現出極弱的殺菌活性(圖11，12)，lysORF94對R196未表現出殺菌活性(圖13)。

M.蛋白Marker;1.ORF86;2.ORF90

M.蛋白Marker;1.ORF86;2.ORF94

2.6 混合蛋白活性檢測結果如表2所示，30 min時混合蛋白可以引起D600值下降，與裂解酶混合后的蛋白或者單一的裂解酶D600值顯著降低，超過30 min后，單獨的混合蛋白基本沒有影響，而與裂解酶混合后會引起D600值降低，但是主要因素仍取決于裂解酶。

M.蛋白Marker;1.ORF98

圖11 LysORF86對處理后AV-X1的作用

圖12 LysORF86對處理后SS42的作用

3 討論

淺綠色氣球菌是一種人畜共患條件性致病菌,廣泛分布于咸肉、空氣中，但臨床上已出現越來越多的人和動物感染淺綠色氣球菌的病例[10]。近年來，已有研究表明淺綠色氣球菌對最常見的抗生素越來越耐藥[11]，已出現萬古霉素耐藥分離株[12],意味著在超級耐藥菌出現之前，尋找新的抗菌方法已經迫在眉睫。

圖13 LysORF94對處理后R196的作用

表2 混合蛋白活性檢測D600值

噬菌體可以特異性的感染并殺死細菌，因此可以利用噬菌體對患者體內感染的細菌進行特異性清除。噬菌體種類繁多，在自然界中廣泛分布，是天然的資源[13]。目前，國內外有許多成功利用噬菌體治愈患者超級耐藥細菌感染的報道[14]。噬菌體裂解酶在噬菌體感染并裂解宿主菌的過程中發揮著重要的作用,而裂解酶作為一種蛋白質，可以通過基因工程的方法大量獲得。這些都表明噬菌體及其裂解酶在替代傳統抗生素療法中具有很好的應用前景。

本研究通過對淺綠色氣球菌噬菌體vB_AviM_AVP的全基因組分析、預測，并通過原核表達的方法，成功獲得了LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98；通過平板涂布滴板試驗，表明LysORF86、LysORF94、LysORF90和LysORF98不具有殺菌活性，這種情況在葛懷娜等[15]噬菌體的裂解酶表達過程中也出現過，可能是因為蛋白的活性不強，不能穿透細菌的細胞壁及細胞膜，因此本研究首先進行酶譜試驗，驗證LysORF86對AV-X1、SS42，LysORF90對AV-X1，LysORF94對R196表現出活性，LysORF98對AV-X1無活性；根據酶譜活性結果，進一步參照CAI等[16]的方法，利用高碘酸以及蛋白酶K處理菌體試驗檢測是否菌體本身影響了蛋白的效果。結果表明，菌體表面的多糖和蛋白可能對蛋白活性存在影響，但并不是主要因素；最后推測蛋白是有功效的，就像噬菌體可以裂解該細菌并非是單獨的蛋白就可以裂解，需要多個蛋白及其他物質的參與，所以推斷，是否混合后的蛋白就可以起到殺菌作用，或與其裂解酶合用能夠增強殺菌能力。本研究通過測量D600值檢測到混合后的蛋白，在30 min時可以略降低D600值，與裂解酶混合后功效也會略有增加，但是并沒有引起顯著變化。超過30 min后，單獨的混合蛋白基本沒有影響，而與裂解酶混合后還是會引起D600值降低，但是主要因素仍取決于裂解酶，這些結果表明，已經表達的蛋白功效尚待進一步研究開發。