重組溶瘤腺病毒對肺癌干細胞的抑制作用

李文杰，蘭 添，王茂鵬，李一權，尚 超，肖朋朋*，孫文超*，金寧一 *， 李 霄*

(1.溫州大學 病毒學研究所，浙江 溫州 325000；2.長春中醫藥大學 吉林省院士工作站，吉林 長春 130122)

癌癥是人類死亡的主要病因之一。2020年，全球大約有1 930萬例新發癌癥病例和近1 000萬癌癥死亡病例,其中肺癌新發病例大約220萬，發病率僅次于乳腺癌居第二位，并且肺癌的死亡率在癌癥中排名第一，大約每年有 180 萬人因肺癌死亡(18%)[1]。在癌癥內部有一部分細胞被稱為癌癥干細胞，這部分細胞在癌癥起始、治療抵抗、轉移和復發中起關鍵作用[2]。這意味著，以肺癌干細胞為靶標可能是根除肺癌的有效治療策略。靶向殺傷癌癥干細胞可能有助于開發針對癌癥的新型治療策略，在治療癌癥時可能具有臨床優勢。

本課題組前期構建了對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用的重組溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a(Ad-VT)[3]，Ad-VT使用腫瘤特異性啟動子 hTERTp來誘導其在腫瘤細胞中的特異性復制，同時含有 VP3 基因，表達具有腫瘤特異性殺傷作用的 Apoptin 蛋白，能夠同時實現在腫瘤細胞中的特異性復制及對腫瘤細胞的特異性殺傷作用。Ad-Mock 為不含 hTERTp和 Apoptin 基因的腺病毒載體。本研究擬利用課題組前期構建的Ad-VT作用于肺癌干細胞，分析重組溶瘤腺病毒對肺癌干細胞的殺傷作用，探討Ad-VT對肺癌干細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料重組溶瘤腺病毒由本實驗室構建并保存；人肺癌干細胞A549-CSC由本實驗室經磁珠分選所得并保存；CCK-8購自日本同仁；JC-1購自美國 Life 公司； Transwell Permeable Support購自美國 Corning公司；BIOCOAT Matrigel 侵襲小室、Annexin Ⅴ-FITC/PI 試劑盒購自美國 BD 公司。

1.2 CCK-8法檢測重組溶瘤腺病毒Ad-VT對肺癌干細胞存活率的影響制備肺癌干細胞A549-CSC 細胞96孔板，每孔5×103個細胞，將制備好的96孔板置于 37℃、5% CO2培養箱中培養 12～24 h。根據 Ad-VT、Ad-Mock 的毒價計算出每孔細胞 100 MOI 的劑量所需的病毒體積。將96孔板取出，分別感染 100 MOI 的重組腺病毒 Ad-VT、Ad-Mock。另外設置未感染病毒的細胞對照組以及無細胞空白組。將感染病毒后的A549-CSC細胞96孔板繼續培養 24～72 h，分別在感染重組腺病毒后24，48，72 h 各取出1個96孔板，避光條件下加入CCK-8，置于 37℃避光孵育4 h后將96孔板放入酶標儀中測定 450 nm 處的D值,計算各組細胞存活率。細胞存活率=[(D試驗孔-D空白孔)/(D對照孔-D空白孔)]×100%。

1.3 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色檢測Ad-VT誘導肺癌干細胞凋亡的作用制備肺癌干細胞A549-CSC 細胞6孔板，每孔5×105個細胞，將制備好的6孔板置于 37℃、5% CO2培養箱中培養 12～24 h。將6孔板取出，分別感染 100 MOI 的重組腺病毒 Ad-VT、Ad-Mock,另外設置未感染病毒的 Control 組。將感染病毒后的A549-CSC細胞6孔板繼續培養 24～72 h，分別在感染重組腺病毒后 24，48，72 h 各取出1個6孔板，收集各孔中的細胞，消化為單細胞后，3 000 r/min 離心 5 min，棄掉上清液，使用 500 μL 的 l×Binding Buffer 懸浮細胞，避光條件下，每個樣品中加入 5 μL 的 AnnexinⅤ-FITC 和 5 μL 的 PI 混勻，避光室溫染色 15 min。染色結束后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.4 JC-1染色檢測Ad-VT對肺癌干細胞線粒體膜電位的影響按照1.3中方法制備A549-CSC細胞6孔板并感染腺病毒，培養24～72 h，分別在感染重組腺病毒后24,48,72 h 各取出1個6孔板，收集各孔中的細胞，消化為單細胞后，3 000 r/min 離心 5 min,棄掉上清液，加入1 mL雙無F12培養基懸浮細胞，避光加入1 μL濃度5 mmol/L的JC-1染液，混合均勻，此時JC-1工作濃度為5 μmol/L，37℃避光孵育30 min。孵育結束后，3 000 r/min 離心 5 min，棄掉上清,雙無F12清洗一次。離心去除上清后，使用500 μL的雙無 F12培養基懸浮細胞，分別使用熒光顯微鏡及流式細胞儀進行線粒體膜電位檢測。

1.5 Transwell 遷移試驗檢測Ad-VT對肺癌干細胞的遷移抑制使用肺癌干細胞A549-CSC 制備24孔板，每孔5×104個細胞，將制備好的24孔板置于 37℃、5% CO2培養箱中培養 12～24 h。將 24 孔板取出，分別感染100 MOI 的重組腺病毒 Ad-VT、Ad-Mock。另外設置未感染病毒的 Control 組。將感染病毒后的 A549-CSC細胞 24 孔板繼續培養24～72 h，分別在感染重組腺病毒后 24,48,72 h 各取出1個24孔板，收集孔中的細胞，消化為單細胞后離心，取一塊新的 24 孔板，每孔加入 500 μL 10% F12，此為下室。放入 Transwell 小室，將細胞轉移至 Transwell小室中，200 μL/孔，此為上室。將 24 孔板繼續培養 24 h后取出，棄去上室中的液體，使用無菌棉簽輕柔地將上層未穿膜的細胞全部拭去，避光在下室中加入 60 μL 的 CCK-8，置于 37℃避光孵育4 h，放入酶標儀中測定 450 nm 處的D值。之后取出 24 孔板，對小室進行結晶紫染色。將 Transwell 小室放入4%多聚甲醛溶液，室溫固定細胞10 min。使用 ddH2O 進行清洗后，將 Transwell 小室放入結晶紫溶液中，室溫下染色 10 min。結晶紫染色結束后，使用 ddH2O 進行清洗，將 Transwell 小室倒置放于室溫下晾干，然后于顯微鏡下拍照，統計穿膜細胞數。

1.6 Biocoat 侵襲試驗檢測Ad-VT對肺癌干細胞的侵襲抑制按照1.5方法制備A549-CSC細胞24孔板并感染腺病毒，培養24～72 h，分別在感染重組腺病毒后 24,48,72 h 各取出1個24孔板，收集孔中的細胞，消化為單細胞后離心，取一塊新的 24 孔板，每孔加入 500 μL 的10% F12，此為下室。放入Biocoat Matrigel 侵襲小室，將細胞轉移至 BIOCOAT Matrigel侵襲小室中，此為上室。將制備好的 24孔板繼續培養24 h，按照1.5的試驗方法進行穿膜細胞的 CCK-8 檢測及結晶紫染色。將BIOCOAT Matrigel 侵襲小室倒置放于室溫下晾干，然后于顯微鏡下拍照，統計穿膜細胞數。

1.7 統計分析數據處理使用統計學軟件SPSS 22.0，數據表示為均數±標準差，結果分析采用t檢驗。P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著差異(*P<0.05，**P<0.01)。

2 結果

2.1 重組溶瘤腺病毒Ad-VT能夠降低肺癌干細胞A549-CSC的存活率結果見圖1。Ad-VT作用于A549-CSC后24～72 h，細胞存活率均顯著低于Control組(P<0.01)，而Ad-Mock作用后細胞的存活率與Control組無顯著性差異。Ad-VT作用于A549-CSC后，細胞存活率隨時間延長而逐漸降低，說明Ad-VT對A549-CSC細胞的作用具有時間效應。

圖1 重組腺病毒對細胞存活率的影響(**P<0.01)

2.2 Ad-VT誘導肺癌干細胞A549-CSC凋亡用Annexin Ⅴ-FITC/PI對凋亡的肺癌干細胞染色后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，檢測結果見圖2。Ad-Mock作用后，A549-CSC細胞未發生明顯凋亡，細胞凋亡率與Control組相比無顯著性差異；Ad-VT作用于A549-CSC細胞后，與Control組相比，細胞發生了不同程度的凋亡(P<0.01)，且細胞凋亡率隨Ad-VT作用時間延長而逐漸增加；說明重組溶瘤腺病毒Ad-VT能夠誘導肺癌干細胞發生凋亡。

2.3 Ad-VT降低肺癌干細胞線粒體膜電位用JC-1對細胞進行染色后，JC-1能夠根據細胞線粒體狀態不同以不同的形式存在從而發射不同顏色的熒光，結果見圖3。使用熒光顯微鏡觀察JC-1染色的細胞，Ad-Mock與Control組細胞線粒體狀態良好，細胞中的JC-1以多聚體形式存在發出紅色熒光；而Ad-VT感染后的細胞紅色熒光減少，綠色熒光增加，說明細胞線粒體膜電位降低，細胞中的JC-1以單體形式存在。經流式細胞儀對細胞熒光強度進行檢測，Ad-VT 組細胞紅色熒光值隨時間延長而逐漸降低。對細胞熒光值統計結果顯示，與 Control 組相比，Ad-VT 組細胞紅色熒光值/綠色熒光值顯著降低(P<0.01)，說明線粒體膜電位發生顯著變化，即 Ad-VT引起A549-CSC細胞線粒體膜電位降低，誘導細胞發生凋亡。以上結果表明重組溶瘤腺病毒Ad-VT能夠通過線粒體途徑誘導肺癌干細胞凋亡。

A.流式細胞儀分析A549-CSC細胞凋亡；B.對A549-CSC 細胞的凋亡定量結果

2.4 Ad-VT抑制肺癌干細胞遷移使用Transwell遷移試驗對細胞的遷移能力進行評價。對遷移細胞進行結晶紫染色，穿膜細胞數統計結果如圖4 所示，Ad-Mock 組與 Control 組細胞隨著時間延長，穿膜細胞逐漸增多；Ad-VT作用A549-CSC后，穿膜細胞逐漸減少，Ad-VT 組穿膜細胞數顯著少于Ad-Mock 組與 Control 組(P<0.01)。CCK-8法檢測結果顯示，Ad-VT 組細胞吸光度值顯著小于 Control 組(P<0.01)，即其穿膜細胞顯著少于 Control 組，說明Ad-VT抑制了A549-CSC 細胞的遷移能力。

A.JC-1染色后通過熒光顯微鏡觀察細胞形態變化;B.A549-CSC細胞的JC-1染色定量結果;C.A549-CSC細胞線粒體膜電位變化

A.遷移穿膜細胞結晶紫染色;B.遷移穿膜細胞數;C.遷移穿膜細胞吸光度值

2.5 Ad-VT抑制肺癌干細胞侵襲使用Biocoat侵襲試驗對細胞的侵襲能力進行評價，結果如圖5所示。對侵襲穿膜細胞進行結晶紫染色，穿膜細胞數統計結果顯示，Ad-Mock 組與 Control 組穿膜細胞逐漸增多；而Ad-VT作用A549-CSC細胞后，穿膜細胞逐漸減少，Ad-VT 組穿膜細胞數顯著少于Ad-Mock 組與 Control 組(P<0.01)。CCK-8法檢測結果顯示，Ad-VT 組細胞吸光度值顯著小于 Control 組(P<0.01)，說明穿膜細胞顯著少于 Control 組，Ad-VT抑制了A549-CSC 細胞的侵襲能力。

A.侵襲穿膜細胞結晶紫染色;B.侵襲穿膜細胞數;C.侵襲穿膜細胞吸光度值

3 討論

盡管化療和放射療法仍然是臨床癌癥治療的主要選擇，但放化療缺乏腫瘤特異性，能夠導致全身毒性及一系列嚴重的不良反應，降低患者的生活質量，且如果不進行手術根治性切除，只有少數癌癥能夠被有效治療。肺癌是嚴重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，發病率和死亡率居高不下[1]。肺癌干細胞是肺癌組織內存在的一群具有干細胞樣特性的細胞，其與癌癥的發生、發展、轉移、耐藥和復發密切相關。盡管放化療能夠破壞大部分腫瘤塊，但仍有一部分癌癥干細胞可以存活并促進癌癥復發，從而導致侵襲性和對療法的抵抗力[4-6]。開發誘導癌癥干細胞選擇性和程序性死亡的治療方法至關重要。重組 DNA 技術是研究病毒生物學的重要工具，從而推進了針對癌癥的生物療法。溶瘤病毒代表著一類新的癌癥治療方法,具有極大的靈活性。作為基因治療和溶瘤病毒的媒介物，腺病毒是流行的基因傳遞載體。

重組溶瘤腺病毒Ad-VT能夠誘導肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞凋亡[3，7-9]，誘導細胞凋亡的途徑主要是通過線粒體途徑[10-11]。Ad-VT不僅能夠誘導腫瘤細胞凋亡，對腫瘤干細胞也具有抑制作用，能夠誘導乳腺癌干細胞凋亡從而殺傷細胞，并且能夠抑制乳腺癌干細胞的遷移侵襲功能，降低乳腺癌干細胞的比例[12]。本研究使用重組溶瘤腺病毒Ad-VT感染肺癌干細胞A549-CSC后，細胞存活率逐漸降低，線粒體膜電位顯著降低，細胞凋亡率隨Ad-VT感染時間延長而逐漸增高。對A549-CSC細胞的遷移及侵襲功能檢測結果同樣提示，Ad-VT能夠抑制肺癌干細胞的遷移侵襲功能。癌癥干細胞參與癌癥發展的所有階段，包括原發腫瘤的發生、發展、轉移及癌癥的復發。Ad-VT能夠殺傷肺癌干細胞，誘導肺癌干細胞發生線粒體途徑的凋亡以及抑制其遷移侵襲能力，經過 Ad-VT針對肺癌干細胞的治療，將使肺癌干細胞失去在肺癌的發展、轉移以及復發中發揮作用的能力。