鴨疫里默氏桿菌三磷酸甘油醛脫氫酶與鴨血漿蛋白的結(jié)合作用

高繼業(yè)，彭俊杰，耿淑炎，黃 偉，黎容紅，李德龍，陳思懷

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 402460；3.重慶更尚科技有限公司，重慶 402460)

鴨疫里默桿菌(Riemerellaanatipestifer，R.anatipestifer)可感染鴨、鵝、火雞及其他鳥類等多種動(dòng)物，出現(xiàn)全身漿膜的纖維素性滲出，產(chǎn)生肝周炎、心包炎和氣囊炎等特征性病理變化[1]。R.anatipestifer血清型的多樣性和不斷增強(qiáng)的耐藥性使之成為當(dāng)前危害我國養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的病原之一[2-5]。盡管關(guān)于R.anatipestifer的研究報(bào)道很多，但主要是全基因組和致病因子方面的研究。其中，GenBank登錄的R.anatipestifer全基因組序列多達(dá)33個(gè)以上，致病因子包括三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G-APDH)、協(xié)同溶血素(CAMP)、毒力相關(guān)蛋白(VapD)、外膜蛋白(OmpA)、明膠酶、載鐵體相互作用蛋白和鐵依賴抑制因子等[6-14]。盡管如此，關(guān)于R.anatipestifer導(dǎo)致感染鴨發(fā)生急性炎性滲出反應(yīng)的可能機(jī)制尚未見報(bào)道。

纖溶酶原是纖維蛋白溶解酶的無活性前體，可被組織型纖溶酶原激活物、尿激酶型纖溶酶原激活物以及激肽釋放酶和凝血酶等激活，溶解血液中的血纖維蛋白，進(jìn)而發(fā)揮抗凝血效應(yīng)[15]。另外，纖維蛋白原是血纖維蛋白的前體，被凝血酶激活后參與完成血液的凝固過程。當(dāng)動(dòng)物血液中纖溶酶原和纖維蛋白原水平發(fā)生異常時(shí)，血液的凝固/纖溶系統(tǒng)機(jī)能可能會(huì)發(fā)生紊亂，進(jìn)而促發(fā)急性或進(jìn)行性炎性滲出反應(yīng)。目前關(guān)于鴨血液凝固/纖溶系統(tǒng)還知之甚少，是否也存在與哺乳動(dòng)物相似的纖溶酶原或纖維蛋白原尚需證實(shí)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，R.anatipestifer能產(chǎn)生具有酶活性的GAPDH同源體RaGAPDH，此同源體與惡性瘧原蟲的GAPDH具有相似的生物學(xué)功能，能與人源和兔源纖溶酶原和纖維蛋白原發(fā)生結(jié)合[14]。但RaGAPDH能否與鴨血液凝固/纖溶系統(tǒng)中的物質(zhì)發(fā)生相互作用，能否對(duì)鴨血液循環(huán)系統(tǒng)的凝固/纖溶機(jī)能產(chǎn)生不利影響，都還需要進(jìn)一步證實(shí)。為此，本研究擬對(duì)R.anatipestifer感染鴨的血漿蛋白進(jìn)行比較分析，并采用Dot-ELISA、Western blot和質(zhì)譜技術(shù)分析可能與RaGAPDH發(fā)生結(jié)合的血漿蛋白成分，期望通過本研究探討引發(fā)R.anatipestifer感染鴨發(fā)生炎性滲出反應(yīng)的分子基礎(chǔ)及可能機(jī)制，為闡明R.anatipestifer感染致病的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，對(duì)預(yù)防與控制R.anatipestifer感染具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株R.anatipestifer血清Ⅰ型、Ⅱ型菌株SC、AF均由本研究室分離、鑒定凍干保存；重組表達(dá)菌BL21(pET-28a+-gap)由本研究室構(gòu)建、保存。

1.2 主要試劑胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soybean broth，TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar，TSA)為OXOID公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、β-巰基乙醇、TEMED、過硫酸銨、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R-250和Western blot試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；IPTG、氨芐青霉素、卡拉霉素為重慶鼎國生物試劑有限公司產(chǎn)品；改良Bradford蛋白定量試劑盒為Vazyme公司產(chǎn)品；蛋白純化試劑盒BeaverBeadsTMIDA-Ni為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及R.anatipestifer感染模型的建立取R.anatipestiferAF株、SC株凍干菌種，劃線接種于TSA平板；挑取平板上長(zhǎng)出的單個(gè)菌落接種到TSB肉湯，以160 r/min 37℃空氣浴振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期,調(diào)節(jié)菌體濃度至109CFU/mL備用。1日齡非免健康四川麻鴨(購自重慶天彬禽苗孵化場(chǎng))在生物隔離器內(nèi)模擬實(shí)際給予光照及充足飲水和飼料，飼養(yǎng)至20日齡行腿部肌肉注射方式分別接種預(yù)先準(zhǔn)備好的菌懸液(0.4 mL/只)；待被接種鴨出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀，經(jīng)病原學(xué)鑒定無誤后無菌采集抗凝血，分離血漿分裝后置于-20℃下保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)設(shè)注射TSB非感染組作為對(duì)照組。

1.4 感染鴨血漿蛋白SDS-PAGE分析及質(zhì)譜鑒定取感染組、非感染組動(dòng)物血漿，經(jīng)改良Bradford法進(jìn)行血漿總蛋白定量后以0.15 mol/L PBS(pH 7.2)作適當(dāng)稀釋；參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(分離膠、濃縮膠濃度分別為10%、5%)。切下2組動(dòng)物血漿蛋白差異條帶，低溫保存送至上海生工生物工程公司作質(zhì)譜鑒定。

1.5 重組RaGAPDH的分離純化及多克隆抗體的制備取參考文獻(xiàn)[14]中構(gòu)建的重組表達(dá)菌E.coliBL21(含重組質(zhì)粒pET-28a+-gap)，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG、37℃下誘導(dǎo)3 h后獲得可溶性重組RaGAPDH。重組RaGAPDH經(jīng)BeaverBeadsTMIDA-Ni顆粒純化、SDS-PAGE分析后采用改良Bradford法進(jìn)行蛋白定量分析，同時(shí)送至上海生工做蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定，并對(duì)重組RaGAPDH酶活性進(jìn)行鑒定。

取適量重組RaGAPDH與弗氏佐劑混合制成免疫抗原，按常規(guī)免疫程序接種健康青年大耳白兔，基礎(chǔ)免疫后加強(qiáng)免疫2次。于最后1次免疫7 d后無菌采血，分離血清，經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定其效價(jià)后分裝低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白成分作用的Dot-ELISA分析采用Dot-ELISA法對(duì)重組RaGAPDH與健康鴨血漿蛋白成分的結(jié)合作用進(jìn)行分析，具體程序如下：取1 μL作適當(dāng)稀釋的健康鴨血漿滴于1 cm2的PVDF膜上，經(jīng)37℃孵育30 min后以0.15 mol/L PBS(pH 7.2)洗滌3次，除去未吸附的血漿蛋白；將PVDF膜用TBS(含5%脫脂奶粉)封閉過夜后與純化的重組RaGAPDH蛋白溶液(10 mg/L)室溫孵育1 h，再用TBST(含0.05%吐溫-20)緩沖液洗滌去除未結(jié)合的重組蛋白；將洗滌后的PVDF膜置含兔抗重組RaGAPDH多克隆抗體的封閉液中，室溫孵育1 h；以同樣的TBST洗滌3次，與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶4 000稀釋)于室溫下孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌3次后以DAB顯色。同時(shí)設(shè)立不包被血漿蛋白的陰性對(duì)照和僅包被重組RaGAPDH陽性對(duì)照。

1.7 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白成分結(jié)合作用的Western blot分析取保存?zhèn)溆玫难獫{，經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后取下凝膠，參照試劑盒說明書進(jìn)行Western blot，分析重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白成分的結(jié)合作用情況。

2 結(jié)果

2.1 重組RaGAPDH的表達(dá)與純化取經(jīng)誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌BL21(pET-28a+-gap)進(jìn)行SDS-PAGE分析,圖譜顯示：gap基因獲得可溶性表達(dá)，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為36.7 kDa(圖1)，與預(yù)期大小相符。

A.重組蛋白表達(dá)(1.IPTG誘導(dǎo)的重組菌裂解上清；2.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌；3.IPTG誘導(dǎo)的重菌);B.重組蛋白表達(dá)(1.BeaverBeadsTM IDA-Ni純化的重組RaGAPDH；M.蛋白Marker)

純化的重組蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和定量分析，結(jié)果顯示，獲得的蛋重組蛋白為RaGAPDH，含量為1.46 g/L(圖2)。純化產(chǎn)物與弗氏佐劑混合后免疫大白兔，獲得的多克隆抗體效價(jià)為1∶128。

圖2 重組RaGAPDH質(zhì)譜分析

2.2 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白成分結(jié)合作用Dot-ELISA分析健康鴨血漿包被到PVDF膜后，再分別與重組RaGAPDH、兔抗重組RaGAPDH多克隆抗體(瓊擴(kuò)效價(jià)1∶16)及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育、DAB顯色，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組的顯色反應(yīng)均呈陽性，陰性對(duì)照組1和2的顯色反應(yīng)均呈陰性(表1，圖3)。

表1 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白作用Dot-ELISA分析

A.試驗(yàn)組；B.陽性對(duì)照1；C.陰性對(duì)照1；D.陰性對(duì)照2

2.3 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白作用Western blot分析及質(zhì)譜鑒定健康鴨血漿蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別與重組RaGAPDH、一抗、HRP標(biāo)記二抗進(jìn)行孵育、顯色，結(jié)果顯示，在97.2，66.4 kDa附近的2條蛋白條帶與重組RaGAPDH的作用呈陽性(圖4)。切下陽性反應(yīng)蛋白條帶，低溫保存送至上海生工生物工程公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，分別為纖溶酶原和富含組氨酸糖蛋白。

2.4R.anatipestifer感染動(dòng)物血漿蛋白的SDS-PAGE分析及質(zhì)譜鑒定取感染鴨血漿，經(jīng)蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。電泳圖譜顯示，AF、SC菌株感染組均與非感染對(duì)照組間存在5條差異蛋白條帶，分別命名為U1、U2、U3、U4、D1(表2,圖5)。利用Quantity One軟件對(duì)電泳圖譜上差異蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，2個(gè)感染組U1、U2、U3、U4蛋白條帶含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，D1蛋白條帶含量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，AF、SC菌株感染組間的蛋白條帶差異不顯著(P>0.05)。

A.纖溶酶原;B.富含組氨酸糖蛋白;1.重組RaGAPDH；2.一抗；3.HRP標(biāo)記二抗；M.蛋白Marker

將5條差異顯著蛋白條帶U1、U2、U3、U4、D1分別回收后送上海生工生物工程公司進(jìn)行質(zhì)譜分析(表2)。結(jié)果顯示，U1為α2-M或血漿銅藍(lán)蛋白，U2為補(bǔ)體3d(C3d)，U3為α-1-酸性類糖蛋白、纖維蛋白原-α鏈，U4可能為α-1-酸性類糖蛋白，D1為富含組氨酸糖蛋白。

A.AF感染組；S.SC感染組；N.對(duì)照組；U1～U4.差異蛋白條帶U1、U2、U3、U4灰度分析；D1.差異蛋白條帶D1灰度分析

表2 感染鴨血漿差異蛋白的質(zhì)譜分析

3 討論

3.1 RaGAPDH可能引發(fā)鴨血液抗凝血能力下降R.anatipestifer能產(chǎn)生和分泌具有酶活性的GAPDH同源體RaGAPDH，該同源體能與人源和兔源纖溶酶原和纖維蛋白原發(fā)生結(jié)合，據(jù)此推測(cè)RaGAPDH可能參與動(dòng)物血液循環(huán)系統(tǒng)機(jī)能紊亂過程[14]。為此，本研究采用Dot-ELISA和Western blot方法研究重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白的相互作用，可能對(duì)鴨血液凝固/纖溶系統(tǒng)機(jī)能產(chǎn)生的影響。Dot-ELISA和Western blot研究結(jié)果顯示，RaGAPDH可與鴨血漿蛋白發(fā)生結(jié)合作用，經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)其主要成分為纖溶酶原和HRG。血纖溶酶是動(dòng)物血液循環(huán)系統(tǒng)中保障血液凝固/纖溶系統(tǒng)機(jī)能正常發(fā)揮的重要成員，可被組織型纖溶酶原激活物、尿激酶型纖溶酶原激活物、FⅫa以及激肽釋放酶和凝血酶等激活，溶解血纖維蛋白，發(fā)揮抗凝血效應(yīng)[15]。本研究中RaGAPDH與纖溶酶原結(jié)合，可能會(huì)抑制纖溶酶原激活，無法發(fā)揮溶解血纖維蛋白的生物學(xué)效應(yīng)，致使血液中纖維蛋白/(原)含量增高，血液凝固/纖溶系統(tǒng)平衡被打破，凝血機(jī)能亢進(jìn)，血液循環(huán)障礙。結(jié)合黎德兵等[16]對(duì)雛鴨感染R.anatipestifer的病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)感染鴨實(shí)質(zhì)器官出現(xiàn)嚴(yán)重腫大和彌漫性充血，故推測(cè)RaGAPDH與纖溶酶原的結(jié)合致動(dòng)物血液纖溶系統(tǒng)的抗凝血機(jī)能下降，血液循環(huán)發(fā)生障礙。另外，HRG是一種富含組氨酸的多功能活性蛋白，可與肝素、纖溶酶(原)、纖維蛋白(原)、血小板和單核細(xì)胞發(fā)生結(jié)合，對(duì)血液凝固系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。RaGAPDH對(duì)鴨HRG的結(jié)合必然導(dǎo)致鴨血液凝固/纖溶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力下降，平衡極易被打破。綜上所述，RaGAPDH可與鴨血漿蛋中的纖溶酶原和HRG發(fā)生結(jié)合，這種結(jié)合可能導(dǎo)致鴨血液纖溶系統(tǒng)的抗凝血能力下降。

3.2R.anatipestifer感染導(dǎo)致動(dòng)物血液凝固/纖溶系統(tǒng)平衡能力下降α2-M是存在于正常人體、鳥類、爬行類及兩棲類動(dòng)物的血液和其他組織內(nèi)的一種非特異性蛋白酶抑制劑，主要由肝細(xì)胞合成并分泌。血液中的α2-M可與血纖維蛋白溶解酶和凝血酶發(fā)生不可逆結(jié)合，發(fā)揮促凝血或抗凝血作用，進(jìn)而參與凝血平衡、纖溶激肽系統(tǒng)調(diào)節(jié)等一系列生理及病理過程[17-19]。研究結(jié)果顯示，R.anatipestifer感染鴨血漿α2-M含量水平顯著增高，表明R.anatipestifer感染導(dǎo)致動(dòng)物血液凝固/纖溶系統(tǒng)的平衡能力下降。另外，R.anatipestifer感染還導(dǎo)致了鴨血漿中HRG含量顯著下降，是否因其表達(dá)分泌的RaGAPDH與之結(jié)合有關(guān)還有待進(jìn)一步研究證實(shí)，但是血漿HRG含量的顯著下降必然也會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物血液凝固/纖溶系統(tǒng)的平衡調(diào)節(jié)能力下降。

3.3R.anatipestifer感染引發(fā)動(dòng)物肝臟急性炎性反應(yīng)和嚴(yán)重?fù)p傷α1-AG主要是由肝臟巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞合成并分泌的一種十分穩(wěn)定的急性時(shí)相蛋白。在正常情況下，動(dòng)物血漿中的含量較低，當(dāng)處在急性感染、炎癥等病理狀態(tài)下，α1-AG水平會(huì)升高[20]。因此，人醫(yī)臨床上常將α1-AG作為急性細(xì)菌感染的標(biāo)志和肝病檢測(cè)的重要指標(biāo)，且其含量水平與肝病變的范圍和損害程度明顯相關(guān)。本研究中感染鴨血漿α1-AG含量顯著增高，據(jù)此進(jìn)一步證實(shí)R.anatipestifer感染會(huì)引發(fā)動(dòng)物肝臟發(fā)生急性炎性反應(yīng)和嚴(yán)重?fù)p傷。

綜上所述，重組RaGAPDH可與鴨血漿中的纖溶酶原和HRG發(fā)生結(jié)合，R.anatipestifer感染鴨血漿α2-M和α1-AG含量顯著增高(P<0.05),HRG含量顯著下降(P<0.05)。研究結(jié)果表明，R.anatipestifer產(chǎn)生的具有酶活性的GAPDH同源體RaGAPDH能與動(dòng)物血漿纖溶酶原和HRG發(fā)生結(jié)合，這種結(jié)合可能導(dǎo)致其血液凝固系統(tǒng)/纖溶系統(tǒng)的平衡出現(xiàn)紊亂和抗凝血機(jī)能下降；R.anatipestifer感染可引發(fā)動(dòng)物肝臟急性炎性反應(yīng)和嚴(yán)重?fù)p傷，及血漿α2-M、α1-酸性糖蛋白含量的顯著增高和HRG含量的顯著下降(P<0.05)，可能導(dǎo)致動(dòng)物血液凝固系統(tǒng)/纖溶系統(tǒng)平衡的自我調(diào)節(jié)能力下降，但能否引發(fā)動(dòng)物彌漫性血管內(nèi)凝血和微血栓的形成，以及R.anatipestifer感染引發(fā)的HRG含量水平顯著下降是否與其分泌表達(dá)的RaGAPDH有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。