蓋塔病毒E2結構域蛋白的原核表達及抗血清制備

仇相書，史 寧，朱翔宇，任世斌，張海森，李 海，魯會軍，金寧一*

(1.西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌712100；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所，吉林 長春130122；3.吉林農業大學 動物醫學院，吉林 長春130122；4.昭蘇縣西域馬業有限責任公司，新疆 伊犁 835600)

GETV在分類上屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)的單股正鏈RNA病毒，其基因組長度約為11 689 nt，包含2個獨立的開放閱讀框架(open reading frames，ORF)，分別位于基因組5′端2/3部分(約7 407 nt)和后1/3部分(約3 759 nt)。前者負責非結構蛋白(non-structural protein，NSP)NSP1～NSP4的編碼，NSP參與病毒RNA轉錄和復制、RNA capping以及多聚蛋白切割等過程；后者則負責編碼結構蛋白，包括Capsid、E3、E2、6K和E1[10]。值得注意的是，由E基因編碼的結構蛋白不僅構成了病毒粒子的表面突起，而且是GETV吸附靶細胞及誘發機體抗感染免疫的關鍵蛋白[11]。E2蛋白主要由3個結構域(A、B和C)組成，其中A和B包含影響免疫原性、病毒吸附和組織噬性的大部分殘基[12]。

本研究對GETV毒株序列進行比對分析后，選擇結構蛋白E2結構域保守區段為靶基因，參照實驗室保存的GETV SD17/09株(GenBank登錄號為MH106780.1)E2基因序列，擴增E2d結構域基因，克隆至原核表達載體，在大腸桿菌表達系統中實現重組蛋白E2d表達；E2d蛋白經純化和透析后，免疫新西蘭兔，以期獲得抗E2d蛋白多克隆抗體，為開展E2蛋白功能研究、GETV檢測方法的建立和病原學研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株與細胞株GETV毒株SD17/09、Vero細胞株由本實驗室保存；感受態細胞BL21(DE3)、DH5α購自大連TaKaRa公司。

1.2 試劑及其他反轉錄試劑盒Vazyme HiS-criptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit購自諾唯贊；Ex Taq PCR酶、T4DNA Ligase、DL5000 DNA Marker、載體pMDTM19-T、載體pET-22b(+)購自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自BioFluX公司；質粒小提試劑盒購自杭州AXYGEN公司；NedⅠ和XhoⅠ、氨芐青霉素、20 000透析袋購自賽默飛公司；Anti-6×His tag抗體Abcam公司產品；山羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物公司；尿素、包涵體蛋白純化試劑盒購自大連TaKaRa；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自Sigma公司。

1.3 引物設計選擇GETV結構蛋白E2結構域保守區段為靶基因，參考GETV SD17/09株中的E2基因序列，設計含酶切位點的Getah-E2 domian片段擴增引物。上游引物Getah-E2d-F添加NdeⅠ酶切位點：cgcatatgACGAAACCGTACCTAGCGTA；下游引物GetahE2d-R添加XhoⅠ酶切位點：CTCGAGTTTGCCTTCAGTTGtc-agctga，斜體下劃線為限制性核酸內切酶識別位點。擴增片段全長1 017 bp，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 目的基因獲取與擴增以GETV SD17/09株為模板，使用Vazyme HiS-criptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉錄成cDNA，具體操作按試劑盒說明書進行。使用上述合成引物將反轉錄產物通過PCR進行擴增，PCR反應體系：ddH2O 13.75 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL,模板4 μL、Ex Taq PCR酶0.25 μL。PCR反應條件：95℃ 預變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 50 s，35個循環；72℃延伸10 min。擴增結束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段，克隆至pMDTM19-T載體。將其轉化至DH5α感受態細胞并涂布于含有氨芐青霉素抗性的固體LB培養基，挑取單克隆菌株在液體LB中培養14～16 h。提取質粒后使用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定并測序，將測序正確的質粒命名為pMD-Getah-E2d。

1.5 重組質粒pET22b-Getah-E2d的構建將驗證正確的pMD-Getah-E2d質粒與原核表達載體pET-22b(+)分別用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段，T4DNA 連接酶連接過夜，轉化至BL21(DE3)感受態細胞中，涂布于含有氨芐青霉素抗性的固體LB平板上，挑取單克隆菌株在液體LB中培養14～16 h，保存菌種并提取質粒后分別用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，將測序驗證正確的重組質粒命名為pET22b -Getah-E2d，保存菌種。

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1.6 重組蛋白Getah-E2d表達形式及鑒定將含有重組質粒的BL-21(DE3)菌種以1∶100的比例接種至10 mL含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養基內，37℃ 220 r/min振蕩培養2～3 h至D600值為0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG繼續培養6 h。12 000 r/min離心10 min棄去上清，用原培養基1/5體積的PBS將沉淀充分重懸，在冰浴條件下進行超聲破碎至菌液澄清透亮，離心收集上清，并將沉淀完全重懸于與上清等體積的包涵體重懸液中(20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L Imidazol、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L Urea、pH7.6)。分別取上清液和沉淀重懸液進行SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定，其中，以鼠源His抗體(1∶2 000稀釋)為一抗，以HRP標記的山羊抗小鼠抗體(1∶4 000 稀釋)為二抗。

1.7 Getah-E2d重組蛋白表達條件優化

1.7.1最佳誘導時間確定 向試管中加入等量的pET22b-Getah-E2d重組菌，37℃ 220 r/min振蕩培養2～3 h至D600值為0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，分別于37℃條件下誘導表達0,2,4,6,8,10,12 h，收集菌體、超聲處理后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.7.2最佳誘導溫度確定 前期處理同1.7.1，分別于16,26,37℃條件下誘導表達相同時間，收集菌體,超聲處理后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.7.3最佳IPTG濃度確定 前期處理同1.7.1，分別加入終濃度為0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0 mmol/L 的IPTG誘導表達，收集菌體,超聲處理后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.8 Getah-E2d重組蛋白的純化及復性復蘇pET-22b-Getah-E2d重組菌，按1∶100比例接種至200 mL含氨芐青霉素抗性的液體LB培養基中，37℃ 220 r/min振蕩培養2～3 h至D600值為0.4～0.6時，按上述優化的誘導條件進行表達。收集超聲處理后的蛋白樣品，參照包涵體蛋白純化試劑盒說明書使用His-bind純化柱對目的蛋白進行純化，取純化過程各個步驟的蛋白樣品通過SDS-PAGE進行鑒定，分析蛋白純化效果。

將純化后的包涵體蛋白裝入透析袋中，使用復性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、pH7.9、250 mmol/L NaCl、6 mol/L Urea)于4℃條件下透析6～8 h，并使用磁懸攪拌器低速攪拌；通過逐步降低復性液中Urea的含量：4，2，1，0 mol/L，并保持其他成分濃度不變，最后透析至PBS溶液中，達到包涵體復性的目的。收集復性后的蛋白，通過SDS-PAGE進行鑒定，并使用BCA蛋白定量試劑盒測定其濃度。

1.9 兔源多克隆抗體的制備選擇3只3月齡、體質量2.0 kg的新西蘭兔，適應性飼養3 d，確認飲食飲水正常后，耳緣靜脈采集血清，通過中和抗體試驗確定血清中無GETV抗體(效價小于1∶4)后作為陰性血清。首免時(0 d)按800 μg/只的劑量，將復性后的Getah-E2d蛋白配伍等體積的完全弗氏佐劑，充分乳化成油包水制劑，背部多點皮下注射和肌肉注射。于首免后7,14,21 d將復性蛋白配伍等體積的不完全弗氏佐劑，進行3次加強免疫，免疫劑量為首免的50%。每次加強免疫前收集耳緣靜脈血，通過血清中和方法檢測血清效價。在24 d對兔進行心臟采血，收集血清，—20℃分裝保存。

1.10 兔源血清中和效價的檢測參考文獻[13]，將本實驗室保存的GETV SD17/09株用于本次血清中和試驗，通過用“固定病毒-稀釋血清”法檢測制備的兔源血清中和效價。將血清倍比稀釋(稀釋倍數從1∶4至1∶8 192)，分別與等體積的GETV病毒液(每孔100 TCID50/50 μL)混合，37℃、5% CO2孵育1 h。取混合液按100 μL/孔接種到單層Vero細胞(5×104個/孔)，37℃、5% CO2繼續孵育。3 d 后觀察細胞病變情況，按Reed-Muench方法計算并以完全抑制病毒生長的最高稀釋倍數的倒數定義為中和抗體效價。

1.11 兔源多抗多克隆抗體的Western blot檢測以復性后的Getah-E2d重組蛋白和ETV為抗原，以本試驗制備的兔源抗Getah-E2d多抗血清(1∶2 000 稀釋)為一抗，以HRP標記的山羊抗兔抗體為二抗(1∶4 000稀釋)，進行Western blot檢測，同時設置陰性血清對照組。

2 結果

2.1 Getah-E2d基因PCR擴增1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，擴增產物在預期大小1 017 bp處出現條帶(圖1)。膠回收后經TA連接克隆至pMDTM19-T載體，雙酶切鑒定和DNA測序結果顯示，該片段與原序列完全一致，表明目的基因擴增成功。

M.DL5000 DNA Marker；1.陰性對照；2.Getah-E2d PCR產物

2.2 重組質粒pET22b-Getah-E2d的構建與鑒定將測序正確的Getah-E2d基因連接至原核表達載體pET-22b(+)，使用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，切出1條大小約1 000 bp的條帶(圖2)，測序結果表明，Getah-E2d基因成功克隆至pET-22b(+)載體。

2.3 重組蛋白Getah-E2d表達形式及鑒定超聲破碎菌液后，分別對離心后的上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳，結果顯示，上清液和沉淀皆能觀察到大小約38 kDa條帶，符合重組蛋白Getah-E2d預期大小，重組蛋白主要以包涵體形式表達(圖3A)；Western blot結果顯示，沉淀條帶單一，信號強，表明重組蛋白Getah-E2d具有良好的反應原性(圖3B)。

2.4 Getah-E2d重組蛋白表達條件優化通過對比不同誘導溫度，不同誘導時間和不同濃度IPTG誘導結果，最終確定最佳誘導條件為37℃、IPTG濃度0.8 mmol/L、誘導表達12 h(圖4)。

M.DL10000 DNA Marker；1.pET22b-Getah-E2d對照；2.pET22b-Getah-E2d雙酶切

A.SDS-PAGE；B.Western blot。1.BL-21對照；2.pET-22b空載體對照；3.重組蛋白pET22b-Getah-E2d上清；4.pET22b-Getah-E2d包涵體；M.蛋白Marker

2.5 Getah-E2d重組蛋白的純化及復性使用His-bind層析柱對Getah-E2d重組蛋白進行純化，純化后的蛋白進行SDS-PAGE鑒定，經含500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，可見約38 kDa的目的蛋白條帶(圖5)。經梯度透析后，測得重組蛋白質量濃度為0.5 g/L。

2.6 兔源多抗多克隆抗體中和效價的檢測以“固定病毒-稀釋血清”法對收集的兔血清進行中和抗體檢測，結果顯示，免疫后7，14，21，24 d血清中和效價分別為1∶128，1∶512，1∶1 024，1∶4 096。

A.不同誘導時間(A2～A8.誘導時間分別為0,2,4,6,8,10,12 h)；B.不同誘導溫度(B2～B4.誘導溫度分別為16,26,37℃)；C.不同誘導劑濃度(C2～C8.誘導劑濃度分別為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,0.0 mmol/L)。M.蛋白Marker；1.Pet-22b空載體對照

M.蛋白Marker;1.pET22b-Getah-E2d純化前;2.穿流液;3.洗雜液;4.洗脫后;5.透析后

2.7 兔源多抗多克隆抗體的Western blot檢測分別以Getah-E2d重組蛋白和GETV全病毒為抗原，以制備的兔源抗Getah-E2d多抗血清(1∶2 000稀釋)和陰性血清為一抗進行Western blot檢測。結果顯示，陰性血清作用下，Getah-E2d組和Getah組均沒有出現條帶；而在制備的多抗血清作用下(免后24 d)，兩組在預期大小處均出現明顯的單一條帶，蛋白大小分別為38，46 kDa(圖6)

圖6 抗Getah-E2d兔源多抗對重組蛋白Getah-E2d及GETV的檢測

3 討論

近年來，我國GETV病的流行問題日益突出，對動物和公眾健康構成極大威脅。雖然目前尚未證實GETV可引起人類疾病，但血清學研究顯示，流行區發熱病人或健康人群中存在該病毒特異性抗體[3]。長久以來，GETV被認為主要由伊蚊和庫蚊攜帶和傳播，但也有在按蚊和阿蚊中發現GETV的報道[14-15]，而這些種類的蚊蟲在中國廣泛分布，數量眾多。李元元等[16]將41株2014年以前分離的GETV毒株與1955年馬來西亞蚊蟲標本分離的GETV-MM2021株比對，發現核苷酸和氨基酸同源性分別為93.8～100.0%和96.0～100.0%，這提示GETV E2結構基因序列較為保守。基于E2基因核苷酸序列的進化分析，GETV毒株可分為Ⅰ～Ⅳ 4個群，1964年以后世界流行的大部分毒株屬于Ⅲ群[16]。

甲病毒屬病毒E2糖蛋白是一種嚢膜蛋白，具有很強的免疫原性[17]。該蛋白含有3個功能結構域(A、B和C)，結構域A和B暴露在病毒嚢膜上，參與病毒吸附過程。這些區域包含中和抗體的抗原表位，在臨床上已作為研發基孔肯雅病毒血清學診斷試驗的靶位點[18]。李向茸等[19]將GETV的E2部分基因(381 bp)克隆到表達載體pGEX-4T-1進行表達并以此為診斷抗原，建立了檢測豬GETV抗體的E2-ELISA方法，但可能由于靶基因不包含E2結構域，導致診斷的特異性較低，且未見生產應用。

本研究對GETV毒株序列進行比對分析后，選擇E2結構域保守區段，截去結構域兩端β帶狀結構，擴增出1 017 bp的Getah-E2d基因片段，并克隆至帶有His標簽的原核表達載體，成功構建重組質粒pET22b-Getah-E2d。經SDS-PAGE和Western blot鑒定，重組蛋白E2d主要以包涵體形式表達；經純化、透析后，將其免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。中和試驗結果顯示，免疫后24 d血清中和抗體效價達到最高，為1∶4 096；BANNAI等[20]將GETV毒株接種試驗馬獲得抗GETV馬源多抗血清，制備的多抗血清能與該GETV毒株發生反應，在30，46，57 kDa出現條帶，分別與Capsid、E1或E2、NSP1或NSP3蛋白大小相對應。Western blot顯示，本試驗制備的多抗血清能與Getah-E2d重組蛋白(約38 kDa)發生特異性反應，同時能與GETV發生反應，在約46 kDa處出現單一條帶，提示該血清與GETV的E1或E2發生特異性反應，表明重組蛋白E2d具有良好的免疫原性，兔源多抗血清制備成功。綜上，本研究成功制備出Getah-E2d重組蛋白及兔源多抗血清，為開展GETV E2蛋白結構域的功能研究、診斷方法的建立和疫苗研發奠定基礎。