大熊貓犬瘟熱抗體間接ELISA方法的初步建立及應用

潘廣林，趙鵬鵬，高更更，雷穎虎，駱 琛，王興龍

(1.秦嶺大熊貓研究中心 珍稀野生動物救護基地，陜西 周至 710402;2.西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

作為中國的標志性物種，大熊貓因其特殊的生態價值和科學價值而受到廣泛的關注。通過建立自然保護區及人工繁殖等一系列措施，大熊貓數量有了較大的增長。但近年來，疾病給大熊貓保護造成嚴重威脅，其中犬瘟熱最嚴重[1-2]。犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一種急性、高致死性傳染病，臨床上以雙相熱、眼鼻黏膜分泌物增多等為主要特征。目前針對該病尚未開發出特異性的藥物，疫苗免疫是預防犬瘟熱的有效措施。由于缺乏大熊貓專用犬瘟熱疫苗，因此多以犬用疫苗代替。但將該類疫苗用于大熊貓等野生動物存在一定的風險，犬用疫苗免疫后引起大熊貓和其他野生動物死亡或發生不良反應的案例在國內外均有報道[3-6]。雪貂源犬瘟熱重組疫苗是一種新型犬瘟熱疫苗，其安全性已經得到驗證[7-9]，但由于缺少犬瘟熱血清學檢測方法，其免疫效果需要進一步研究確定。

對大熊貓全基因組及IgG重鏈的分析表明，大熊貓與犬的基因組最接近[10-11]，提示抗犬IgG二抗具有可替代抗大熊貓IgG二抗用于大熊貓疾病血清檢測的可能。葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A，SPA)作為金黃色葡萄球菌細胞壁上的蛋白成分，能與大多數動物的IgG Fc片段非特異性結合，可替代傳統酶標二抗用于傳染病的診斷[12]，但SPA能否用于大熊貓疾病的血清學檢測尚不明確。本研究以CDV H和F蛋白的短肽作為包被抗原，用實驗室制備的抗大熊貓IgG Fc二抗、商品化的抗犬IgG二抗及SPA做二抗，探究3種二抗應用于大熊貓犬瘟熱血清學檢測的可行性，并以建立的方法評估大熊貓的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 多肽和血清CDV H和F蛋白多肽由合肥國肽生物公司合成；大熊貓血清(免疫犬瘟熱疫苗2周后采集，間隔9個月)由陜西省林業科學院珍稀野生動物救護基地提供。

1.2 主要試劑和材料HRP標記的鼠抗大熊貓IgG Fc二抗由實驗室前期制備保存；HRP標記的兔抗犬IgG二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；HRP標記的SPA購自博士德生物工程有限公司；TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；CDV抗體ELISA 檢測試劑盒購自上海加科生物科技有限公司。

1.3 最適包被質量濃度的確定利用方陣滴定法確定最適包被濃度。將CDV多肽以50 mg/L的起始質量濃度，2倍倍比稀釋包被于酶標板，100 μL/孔，37℃孵育2 h。PBST洗滌3次，以10%的脫脂乳封閉2 h。PBST洗滌3次，獲得包被好的反應板。

將大熊貓血清以1∶50的起始濃度包被于酶標板，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，加入HRP標記的鼠抗大熊貓IgG Fc二抗(100 μL，1∶1 000稀釋)。PBST洗滌5次，加入50 μL TMB，37℃顯色15 min，加入50 μL終止液，反應結束后測定陽性血清和陰性血清D450比值(P/N)，確定抗原和血清的最適包被濃度。

1.4 酶標二抗最佳稀釋倍數的確定將大熊貓血清1∶100稀釋后包被于酶標板，HRP標記的鼠抗大熊貓IgG Fc二抗和HRP標記的兔抗犬IgG二抗做1∶1 000～1∶4 000的2倍倍比稀釋，HRP標記的SPA做1∶500～1∶2 000的2倍倍比稀釋，反應結束后測定D450值，確定酶標二抗的最佳稀釋倍數。

1.5 符合率試驗確定抗原、血清最適包被濃度以及酶標二抗最佳稀釋倍數后，利用建立的3種ELISA方法和商品化犬瘟熱抗體試劑盒對12份大熊貓犬瘟熱疫苗首免血清進行檢測，比較3種方法和商品化犬瘟熱抗體試劑盒檢測結果的一致性。

1.6 敏感性試驗在最佳反應條件下，對2倍倍比稀釋的大熊貓陽性血清和陰性血清(1∶100～1∶12 800)進行檢測，反應結束計算P/N，比較3種二抗用于大熊貓犬瘟熱抗體檢測的敏感性。

1.7 重復性試驗利用建立的3種ELISA檢測方法對12份血清進行批內和批間重復性試驗，批內試驗和批間試驗均做3個重復，計算批內和批間差異的變異系數。

1.8 血清抗體檢測根據上述試驗確定的抗原、血清和酶標二抗的最適反應濃度，利用建立的3種ELISA方法對前后2次犬瘟熱疫苗免疫的大熊貓血清進行檢測，計算3種方法測得的二免與首免D450差值的平均值，得出免疫前后血清抗體水平的變化。

2 結果

2.1 最適包被質量濃度的確定根據反應結束D450和P/N值的最大值，確定最適抗原包被質量濃度為25 mg/L，血清最佳稀釋倍數為1∶100(圖1)。

圖1 最適包被質量濃度的確定

2.2 酶標二抗最佳稀釋倍數的確定將倍比稀釋的3種酶標二抗與大熊貓血清反應，確定D450值最大時對應的稀釋度為其最佳稀倍數，抗大熊貓二抗、抗犬二抗、SPA的最佳稀釋倍數分別為1∶1 000，1∶1 000，1∶500(圖2)。

2.3 符合率試驗檢測12份免疫犬瘟熱疫苗的大熊貓血清，結果顯示鼠抗大熊貓二抗、兔抗犬二抗、SPA和商品化犬瘟熱抗體試劑盒(犬用)4種方法檢測的陽性率分別為100%,92%,100%,50%。表明建立的3種ELISA檢測方法符合率較高，一致性較好，陽性檢出率遠高于商品化試劑盒(圖3,表1)。

2.4 敏感性試驗將3種檢測方法在P/N值≥2.1時對應的血清最大稀釋度確定為該檢測方法的敏感性，分別為1∶400，1∶100，1∶100(圖4)。

圖2 酶標二抗最佳稀釋倍數的確定

圖3 3種檢測方法一致性比較

表1 3種檢測方法和商品化試劑盒一致性比較

圖4 3種檢測方法的敏感性試驗

2.5 重復性試驗利用鼠抗大熊貓二抗、兔抗犬二抗和SPA建立的檢測方法批內重復性試驗的變異系數分別為0.06%～8.06%,0.16%～8.04%,2.27%～4.92%;批間重復性試驗的變異系數分別為0.70%～9.26%,0.90%～8.52%,0.65%～8.87%，表明3種檢測方法的重復性較好(表2)。

表2 3種檢測方法的重復性試驗 %

2.6 血清抗體檢測結果前后2次免疫過犬瘟熱疫苗的大熊貓血清抗體檢測結果顯示，二免過后， 50%(6/12)的個體抗體水平升高0.2以上，25%(3/12)的個體抗體水平升高0.1～0.2，25%(3/12)的個體抗體水平升高0.1以下(圖5)。

圖5 大熊貓2次免疫犬瘟熱疫苗抗體水平變化

3 討論

犬瘟熱是由CDV引起的一種急性高致死性疾病，該病目前在全世界廣泛流行，在中國主要流行的基因型是亞洲-1型[13-14]。自然條件下CDV主要感染包括犬科、鼬科、貓科在內的多種食肉目動物，但近年來CDV的宿主范圍不斷擴大，已經嚴重威脅到大熊貓的生存[1,2,15]。CDV是副黏病毒科、麻疹病毒屬的一種有囊膜的單股負鏈RNA病毒[16]，基因組全長15 690 nt，分別編碼核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基質蛋白(matrix protein，M)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素蛋白(hemagglutinin protein，H)、大聚合酶蛋白(large protein，L)6個蛋白[17]。H和F蛋白上存在許多抗原表位[18]，免疫原性較好，在抗感染免疫和誘導中和抗體的產生等方面發揮著重要作用[19-20]。梅里亞公司已研發出雪貂源的犬瘟熱H和F蛋白金絲雀痘病毒重組活載體疫苗，該疫苗安全性已得到廣泛驗證。國外研究人員曾對來自中國的2只大熊貓免疫該重組疫苗并監測其抗體的動態變化，結果表明該疫苗可以誘導機體產生較高水平的中和抗體，能為大熊貓提供1年的免疫保護[9]。近期一項針對5只大熊貓免疫該疫苗后的血液轉錄組研究結果表明，該疫苗主要通過固有免疫應答和細胞免疫來發揮免疫保護作用，缺乏足夠的記憶細胞維持長期免疫[21]。

通過將鼠抗大熊貓IgG Fc二抗、兔抗犬IgG二抗和SPA應用于大熊貓犬瘟熱間接ELISA診斷，結果表明3種二抗均可用于大熊貓犬瘟熱抗體的血清學檢測，建立的3種檢測方法對于樣本的檢測結果趨于一致，相比商品化試劑盒具有更高的準確性。利用大熊貓二抗建立的診斷方法敏感性更高，可作為首選二抗，但在缺乏大熊貓二抗時可選擇另外2種二抗進行替代。通常認為，犬瘟熱的抗體達到1∶100就具備對犬的完全免疫保護力，但對大熊貓是否具有免疫保護尚缺乏足夠的試驗論證。對大熊貓前后2次疫苗免疫的血清抗體監測結果表明，12只大熊貓在2次免疫后都產生了超過1∶100的中和抗體，但針對犬瘟熱金絲雀痘病毒重組活載體疫苗的免疫應答，無論首免還是二免，都存在不同程度的個體差異，二免后僅有50%的個體產生了更強的再次免疫應答，提示在實際免疫過程中應根據不同個體制定免疫程序。由于間接ELISA的影響因素較多，無法對其試驗條件逐一進行優化，本研究中建立的檢測方法尚有一定的局限性，后續仍需做進一步的改進。

本研究對鼠抗大熊貓IgG Fc二抗、兔抗犬IgG二抗以及SPA用于大熊貓犬瘟熱抗體血清學檢測的可行性進行了試驗論證，初步建立了針對大熊貓犬瘟熱的血清學檢測方法，完成了對大熊貓前后2次疫苗免疫血清抗體水平的評估，對大熊貓犬瘟熱血清學檢測試劑盒的開發、疫苗免疫效力的評估以及犬瘟熱防控水平的提升具有重要意義。