豬圓環病毒2型和4型雙重PCR檢測方法的建立

徐 通,侯承堯，田潤博,崔建濤,趙 麗，陳紅英*

(1.河南農業大學 動物醫學院，河南 鄭州 450002；2.河南牧業經濟學院 動物醫藥學院，河南 鄭州 450046)

豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是迄今為止發現的一種最小的、無囊膜的、單股環狀DNA病毒，其全基因組含有1 766～1 779個堿基[1-2]。豬圓環病毒病(PCVAD)是由PCV2引起的一系列疾病的總稱，主要包括患斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、仔豬先天性震顫(CT)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)以及繁殖障礙疾病[3-6]。自2000年郎洪武等[7]在我國報道PCV2以來，我國豬群PCVAD頻發，且死亡率不斷增加，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。

2019年ZHANG等[8]報道在患有PCVAD的豬中發現了1種新型PCV，命名為豬圓環病毒4型(PCV4)。該病毒的基因組大小為1 770 nt，其結構與PCV2相似，主要編碼Cap和Rep2個基因，其中Cap基因為687 nt，編碼228個氨基酸；Rep基因為891 nt，編碼296個氨基酸。TIAN等[9]從患有嚴重臨床疾病(包括PDNS、腹瀉和呼吸道癥狀)的豬中鑒定出PCV4，表明PCV4與PCVAD密切相關。

PCV2感染可引起豬免疫抑制，臨床上經常出現 PCV2 與豬其他病原共感染，使PCVAD的臨床表現變得復雜，且發病豬死亡率增加[10-11]。已有多個研究表明臨床上PCV4常與PCV2混合感染[8-9]。為了監控PCVAD疫情，急需建立一種快速、準確、操作簡單、靈敏和特異的PCV2/4檢測方法。目前PCV2和PCV4已有單一PCR檢測方法，迄今尚未有同時檢測2種病原的方法。因此，本試驗建立了一種特異、靈敏且同時檢測和鑒別PCV2/4的雙重PCR方法，為監測PCV2/4在我國的發生與流行提供分子診斷技術支持，對于PCV2/4的流行病學調查具有重要現實意義。

1 材料與方法

1.1 病毒株和臨床樣品PCV2、偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬傳染性胃腸炎(TGEV)、大腸桿菌(E.coli)、豬傷寒沙門菌(Salmonellatyphisuis)均保存于鄭州豬重大疫病防控重點實驗室。利用本試驗室田潤博等[12]建立的單一PCR方法對保存于鄭州豬重大疫病防控重點實驗室的病料進行PCV4檢測，對檢測為陽性的病料進行擴增、測序，作為PCV4陽性對照。

2018—2020年，從河南、山西不同地區豬場，采集60份疑似PCV感染的組織樣品(包括脾、淋巴結和肝臟)。取適量組織，經研磨后反復凍融3次，12 000 r/min 離心5 min，-80℃保存備用。

1.2 主要試劑UNIQ-10柱式病毒基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；2×Taq Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設計參照GenBank中收錄的PCV2(EU148503、HM038017、KX828234、KX831480)和PCV4(MK986820)全基因序列，用Megalign(DNA Star)進行比對，針對PCV2Rep基因和PCV4Cap基因高度保守區域，利用引物設計軟件Primer 5.0，分別設計1對特異性檢測引物P1F/R和P2F/R (表1)，用于擴增PCV2(264 bp)和 PCV4 (391 bp)。引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.4 單一PCR擴增及標準陽性質粒的構建病毒基因組DNA抽提試劑盒提取病毒DNA，利用引物P1F/R和P2F/R分別對PCV2和PCV4擴增。反應體系均為25 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2 μL、ddH2O補充至25 μL。反應程序為95℃ 5 min；95℃ 25 s，55℃ 25 s，72℃ 35 s(共35個循環)；72℃ 10 min。PCR反應結束后，用1%凝膠電泳檢測擴增結果。

表1 雙重PCR引物序列

利用微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒對PCR擴增產物進行純化回收，并與 pMD18-T連接。將連接產物轉至DH5α感受態細胞，將鑒定為陽性的菌落擴大培養，提取重組質粒(pMD18-PCV2和pMD18-PCV4)進行測序，并將測序結果與GenBank登錄的參考序列進行同源性對比。用紫外分光光度計分別測定2種陽性重組質粒的濃度，同時計算其拷貝數。

1.5 雙重PCR檢測方法的建立與條件的優化對雙重PCR檢測方法的引物濃度比例、退火溫度(53～63℃)、時間(變性、退火、延伸)進行摸索，最后得出最佳反應條件。

1.6 雙重PCR特異性試驗以PCV2、PCV4、CSFV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、E.coli、Salmonellatyphisuis的核酸為模板，同時設立陰性對照，用1.5建立的雙重PCR方法進行擴增，以檢測該雙重PCR方法的特異性。

1.7 雙重PCR的靈敏性試驗將質粒pMD18-PCV2和pMD18-PCV4等體積混合，將混合的質粒進行10倍系列稀釋。通過1.5中摸索的最佳條件，以各個稀釋度的標準質粒作為模板進行PCR擴增,以檢測本方法的靈敏度。

1.8 雙重PCR方法的重復性試驗對來自不同地區的3份PCV2和PCV4混合感染的病料，通過1.5建立的雙重PCR檢測方法進行擴增，并且在隨后的2周內重復3次，以檢測該方法的重復性。

1.9 臨床樣品檢測利用雙重PCR檢測方法，對采自河南和山西的洛陽、濮陽、焦作、許昌、汶水等10個地級市16個養殖場的60份病料進行檢測，并與單一PCR檢測結果作比較，評價其臨床實用性。

2 結果

2.1 單一PCR擴增結果利用P1F/R和P2F/R對PCV2和PCV4陽性病料DNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，擴增的片段位置約在264 bp (PCV2)和391 bp (PCV4)處(圖1)，與預期大小相符。將單一PCR純化產物連接到pMD18-T并測序，測序結果與參考序列之間的同源性為99%以上，表明PCR產物為PCV2和PCV4的目的片段。

2.2 雙重PCR擴增條件優化及擴增結果通過對雙重PCR擴增條件的摸索，最終確定反應體系為25 μL:2×Taq Master Mix 12.5 μL，P1F/R各0.7 μL，P2F/R各0.3 μL，模板2 μL,ddH2O補充至25 μL。反應程序為95℃ 5 min；95℃ 25 s，56℃ 25 s，72℃ 30 s(35個循環)；72℃ 10 min。

M.DL1000 DNA Marker；1.PCV2/4雙重PCR產物；2.PCV2產物；3.PCV4產物；4.陰性對照

2.3 雙重PCR的特異性試驗結果利用已優化的雙重PCR方法對PCV2/4、CSFV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、E.coli和Salmonellatyphisuis核酸進行擴增，同時設立陰性對照。結果顯示，PCV2/4混合模板擴增出了2個條帶(圖2)，大小分別為264(PCV2)和391 bp(PCV4)，而其他病原的核酸及陰性對照均未出現特異性條帶，表明該方法具有良好的特異性。

M.DL1000 DNA Marker；1.PCV2/4 PCR產物；2～9.CSFV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、E.oli、Salmonella typhisuis PCR產物；10.陰性對照

2.4 雙重PCR的靈敏度試驗結果經紫外分光光度計測量標準陽性質粒的濃度，計算出PCV2/4的拷貝數分別為6.11×1010,5.49×1010拷貝/μL。將2種標準陽性質粒(pMD18-PCV2和pMD18-PCV4)等體積混合，然后進行10倍系列稀釋。以10-1～10-10稀釋濃度的混合質粒為模板，ddH2O為陰性對照，進行雙重PCR擴增。PCV2/4混合質粒在10-9稀釋濃度時能擴增出目的條帶，最低檢測限分別為61.1，54.9 拷貝/μL，表明該方法具有很好的敏感性(圖3)。

M.DL1000 DNA Marker；1～10.PCV2/4混合陽性模板10-1～10-10梯度稀釋后擴增結果；11.陰性對照

2.5 雙重PCR重復性試驗結果通過已優化的雙重PCR方法對來自不同地區的3份PCV2/4混感病料的DNA進行擴增，同時設立陰性對照，并在不同的時間段做3次重復，每次檢測結果都是PCV2/4為陽性，表明本試驗所建立的方法具有良好的重復性。

2.6 臨床診斷應用利用本試驗建立的雙重PCR方法對從山西和河南省不同地區采取的60份臨床樣品進行檢測,結果顯示PCV2的檢出率為51.67%(31/60)，PCV4的檢出率為18.33%(11/60)，混合感染檢出率為16.67%(10/57)，雙重PCR檢測結果與單一PCR檢測結果一致，表明該方法可用于臨床檢測。

3 討論

目前，PCV2仍然在我國大多數省份流行，且各個地區PCV2陽性檢出率存在一定差異[13-15]。ZHANG等[8]從患有PCV的病料中發現一種新型的豬圓環病毒，命名為PCV4，而且本試驗從1份患有PMWS的仔豬檢測出PCV4，而未檢測到PCV2和PCV3,表明PCV4可能與PCV有關。PCV4在河南、四川、山西省等多個省份廣泛存在，而且PCV2和PCV4存在混合感染[8-9]。因此，為了更好地防控PCVAD，臨床上迫切需要建立一種可以同時檢測這2種病毒的PCR方法。

田潤博等[12]建立檢測PCV4的單一PCR檢測方法，而無法檢測臨床上出現的PCV2和PCV4混合感染。已有研究者分別建立了針對PCV2和PCV4的熒光定量PCR方法[16-17]，但熒光定量PCR方法成本和操作要求都比較高，很難滿足實際生產中養豬業大批量樣品的檢測。因此，本試驗建立了一種快捷、操作簡單且成本低的雙重PCR方法，為實際生產中PCV2/4的防控提供技術支持。

針對PCV2檢測引物設計時，發現PCV1在Rep基因的65～73 bp處有9個堿基缺失，而在這段序列附近PCV2各基因型毒株之間相對保守。因此，將PCV2檢測引物P1F的3′端設計在這個區域，既可以確保擴增PCV2不同基因型，又可以避免因PCV1引起的非特異性擴增。本試驗進行一系列引物濃度比摸索時，發現P2F/R的擴增效率高于P1F/R，當P1∶P2引物濃度比為7∶3對擴增效果最佳。同時對退火溫度、時間(變性、退火、延伸)進行優化。通過優化后的PCR方法擴增出的片段分別在264 (PCV2)和391 bp(PCV4)的位置，相差127 bp，凝膠電泳成像儀中能夠清晰地分辨出兩種病原體。而其他8種常見的病原體檢測為陰性，并且本試驗在不同的時間段做3次重復，每次結果一致，說明本試驗所建立的雙重PCR檢測方法具有良好的特異性。本試驗對3份PCV2/4混合感染樣品在不同的時間段重復3次，每次單一PCR方法和雙重PCR方法擴增結果完全一致，說明該方法具有良好的重復性和準確性。本試驗的靈敏度檢測結果顯示PCV2最低檢測限為61.1拷貝/μL，這與周忠濤等[18]建立的PCV2的PCR檢測下限相當；PCV4最低檢測限為54.9 拷貝/μL，與田潤博等[12]建立的檢測PCV4的PCR方法檢測下限相當，說明本試驗建立的雙重PCR方法具有良好的靈敏度。

運用本試驗建立的雙重PCR方法，對河南洛陽、焦作、濟源和山西地區汶水、長治等10個地市16個豬場收集的60份病料樣品進行檢測，PCV2的檢出率為51.67%(31/60)，PCV4的檢出率為18.33%(11/60)，PCV2/4混合感染的檢出率為16.67%(10/60)，雙重PCR結果與單一PCR結果完全一致，表明PCV2和PCV4在河南和山西存在單獨感染和混合感染的情況且比較嚴重，應加強對其的檢測及防控。PCV2是PCVAD的主要致病原，但單獨感染PCV2很難復制出PCVAD臨床癥狀[19]。DORRD等[20]報道大多數PCVAD由PCV2和其他豬病原共感染引起的，僅少數PCVAD由 PCV2單獨感染引起。而且，其他豬病原與PCV2有協調作用，能增強PCV2對所感染組織器官所造成的損傷，還會提高PCVAD的傳播風險[10-11]。推測PCV4與 PCV2共感染可能會引起PCVAD，并且使發病豬病情加重、病死率增加，給養豬業帶來更大的危害。

目前PCV4沒有被分離出來，從本試驗的臨床檢測結果可以看出，PCV4可能是PCV的病原之一，且PCV2/4混合感染已經存在于國內山西、河南、四川等多個省份，可能促進PCVAD在我國的傳播。本研究建立了一種特異性好、靈敏度高且成本低易操作的雙重PCR方法，可達到單重PCR檢測效果的同時極大地節約試驗成本，更符合臨床上大批量樣品診斷的需求，大大減少檢測時的任務量，為我國臨床上PCV2/4的檢測和防控提供技術支持。