PRRSV HeN-3弱毒株不同途徑感染仔豬誘導(dǎo)天然免疫因子差異性比較

孫楊楊，李 聞，趙士杰，苗信永，孔令昊，崔志瑩，徐朋麗，陳 雨，張改平，2，陳 靜，張宜娜*，夏平安*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的主要以母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸系統(tǒng)癥狀為臨床特征的傳染病[1]。PRRSV感染豬只后誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫抑制[2]、抗體依賴性增強(qiáng)作用[3]和持續(xù)感染[4]等現(xiàn)象給PRRS的防控造成了極大的困難，豬場(chǎng)一旦感染，很難徹底消除，潛在危害極大，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)極大的損失[5]。

目前有關(guān)PRRSV感染仔豬的研究資料表明，強(qiáng)毒株感染仔豬后，病毒血癥明顯，拷貝數(shù)高，誘導(dǎo)豬只產(chǎn)生干擾素的水平低，炎性因子水平高，臨床癥狀及病理變化明顯，弱毒株感染仔豬后免疫抑制較弱，豬只臨床癥狀及病理變化不明顯[6-9]。然而，對(duì)PRRSV經(jīng)不同途徑感染仔豬誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的差異尚未有系統(tǒng)的研究。本課題組前期研究證明PRRSV VR2332弱毒株經(jīng)滴鼻與注射兩種途徑感染仔豬，病毒血癥出現(xiàn)時(shí)間、病毒拷貝數(shù)及中和抗體水平都存在一定的差異，注射組病毒血癥出現(xiàn)早，病毒拷貝數(shù)高，注射組血清中的中和抗體效價(jià)也比滴鼻組高，其中和抗體效價(jià)最高可達(dá)到l∶8，可以對(duì)病毒起到一定的中和作用[10]。為了進(jìn)一步了解PRRSV弱毒株經(jīng)滴鼻和注射兩種途徑感染仔豬后誘導(dǎo)天然免疫因子產(chǎn)生的規(guī)律及差異，使用本實(shí)驗(yàn)室分離保存的弱毒株P(guān)RRSV HeN-3，經(jīng)滴鼻和注射兩種途徑感染仔豬，通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)兩種途徑感染后血清中病毒拷貝數(shù)及外周血淋巴細(xì)胞中天然免疫因子IFN-α、TNF-α、IL-1β的相對(duì)表達(dá)量，通過(guò)ELISA Kit 檢測(cè)血清中干擾素蛋白水平，通過(guò)制作肝臟、脾臟、腎臟的病理切片，觀察滴鼻與注射兩種途徑感染仔豬后對(duì)機(jī)體造成的損傷。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、病毒毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20日齡健康大白仔豬購(gòu)自鄭州郊區(qū)某豬場(chǎng)，其中PRRSV、豬瘟病毒(CSFV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原、抗體均為陰性；Marc-145細(xì)胞和PRRSV HeN-3弱毒株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Porcine IFN-alpha ELISA Kit 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司;RPIM 1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；枸櫞酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 病毒增殖選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Marc-145細(xì)胞，待其長(zhǎng)至80%左右的單層后，將適量的PRRSV HeN-3株接種于細(xì)胞上，37℃吸附作用1 h后，加入含2%胎牛血清的DEME培養(yǎng)液，于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次，離心收獲上清即為病毒液，根據(jù)Karber法[11]計(jì)算病毒的 TCID50為10-4/100 mL。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)將 12 頭 20 日齡健康仔豬隨機(jī)分為滴鼻組、注射組和對(duì)照組3組，各組之間隔離飼養(yǎng)。將PRRSV HeN-3弱毒株分別以滴鼻和肌肉注射方式感染仔豬(1×106TCID50/頭)，對(duì)照組接種健康Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)物。分別于感染后0，3，7，11，15，19，23，27，31，35，39，43 d前腔靜脈采取抗凝血及凝血，分離外周血淋巴細(xì)胞及血清。用ELISA Kit 檢測(cè)血清中干擾素蛋白水平，用實(shí)驗(yàn)室建立的熒光定量方法[12]檢測(cè)PRRSV的拷貝數(shù)和細(xì)胞因子IFN-α、TNF-α、IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量。43 d 后剖殺仔豬，取淋巴結(jié)等免疫組織檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，取肝臟、脾臟、腎臟制作病理切片。

2 結(jié)果

2.1 血清中病毒拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果接種前仔豬血液中的病毒核酸常規(guī)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性，滴鼻組于感染后7 d出現(xiàn)病毒血癥并持續(xù)到15～19 d，在27～31 d再次出現(xiàn)后又迅速消失；注射組于感染后3 d出現(xiàn)病毒血癥并持續(xù)到19 d，于31 d再次出現(xiàn)后又迅速消失；對(duì)照組未出現(xiàn)病毒血癥。

滴鼻組于免疫后7 d，注射組于3 d，病毒拷貝數(shù)均達(dá)到103拷貝/μL。在免疫后15 d病毒拷貝數(shù)最高，滴鼻組達(dá)到104拷貝/μL，注射組達(dá)到105拷貝/μL，之后逐漸降低。滴鼻組、注射組分別于免疫后27,35 d病毒血癥消失。病毒血癥的變化規(guī)律表明注射組比滴鼻組的病毒血癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)并且病毒含量高。病毒含量及增殖規(guī)律如圖1所示。

圖1 不同時(shí)間段病毒拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.2 外周血及淋巴細(xì)胞中天然免疫因子檢測(cè)結(jié)果

2.2.1IFN-α蛋白水平及mRNA的表達(dá)量 IFN-α蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，滴鼻組IFN-α 蛋白水平從3 d開(kāi)始升高，19 d后恢復(fù)正常水平，3～15 d顯著高于對(duì)照組。注射組與滴鼻組變化趨勢(shì)一致，在3～15 d時(shí)注射組的IFN-α水平低于滴鼻組水平且有顯著性差異(圖2)。

IFN-α相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，注射組在免疫后3 d 相對(duì)表達(dá)量迅速降低，之后呈上升趨勢(shì)，到11 d 時(shí)達(dá)到最高，隨之下降，19 d時(shí)顯著低于對(duì)照組，23 d 后緩慢上升，27 d與對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量趨于同一水平；滴鼻組在免疫后3 d開(kāi)始下降，7 d降到最低，19 d時(shí)達(dá)到最高，之后下降在27 d后基本與對(duì)照組趨于相平。兩組試驗(yàn)結(jié)果相比，滴鼻組IFN-α表達(dá)量下調(diào)持續(xù)的時(shí)間比注射組長(zhǎng)，并且也提前達(dá)到最高，在27 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量基本在同一水平上(圖3)。

2.2.2炎性因子TNF-α mRNA的表達(dá)量 滴鼻組TNF-α mRNA表達(dá)量在感染后3 d顯著升高，在7 d 達(dá)到最高，之后雖呈現(xiàn)降低趨勢(shì)但至15 d都顯著高于對(duì)照組，19～23 d與對(duì)照組趨于相同水平，27～35 d又再次呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且顯著高于對(duì)照組，39 d后與對(duì)照組趨于相同水平。注射組TNF-α mRNA表達(dá)量在感染后變化趨勢(shì)與滴鼻組相似，只是注射組在3 d就達(dá)到最高水平。兩種不同途徑感染的結(jié)果相比，雖變化趨勢(shì)基本相似，但整體來(lái)看，除個(gè)別時(shí)間段，滴鼻組的表達(dá)量一直高于注射組(圖4)。

2.2.3炎性因子IL-1β mRNA表達(dá)量 滴鼻組IL-1β mRNA表達(dá)量在感染后3 d開(kāi)始升高，7 d達(dá)到最高水平，隨后降低，15 d時(shí)與對(duì)照組趨于相同水平。注射組IL-1β mRNA表達(dá)量的變化趨勢(shì)與滴鼻組相似。兩種不同途徑感染結(jié)果相比，雖變化趨勢(shì)基本相似，但整體來(lái)看，升高趨勢(shì)時(shí)段內(nèi)(3,7 d)滴鼻組的IL-1β mRNA水平高于注射組(圖5)。

*.與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)；**.與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；***.與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。下同

圖3 試驗(yàn)組IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化

圖4 試驗(yàn)組TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化

2.3 組織病理切片結(jié)果肝臟病理切片結(jié)果顯示，滴鼻組肝臟肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列緊密、著色均勻、界限清晰、形態(tài)正常，組織未見(jiàn)明顯異常。注射組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列緊密，較多肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松淡染，部分呈空泡狀(黑色箭頭)(圖6B)，局部可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(黃色箭頭)，未見(jiàn)其他明顯異常(圖6C)。

脾臟病理切片結(jié)果顯示，滴鼻組脾臟紅白髓分界清晰、局部白髓消失、紅髓淋巴細(xì)胞排列疏松，可見(jiàn)較多橢圓體，未見(jiàn)其他明顯異常(圖7B)。注射組脾臟紅白髓分界清晰，白髓淋巴細(xì)胞豐富、排列緊密、紅髓結(jié)構(gòu)緊密，可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞散在浸潤(rùn)(黑色箭頭)(圖7C)。

圖5 試驗(yàn)組IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化

腎臟病理切片結(jié)果顯示，注射組腎臟皮髓質(zhì)分界清晰，腎小球毛細(xì)血管較清晰，腎皮質(zhì)多見(jiàn)腎小管擴(kuò)張(黑色箭頭)，局部腎小管管腔內(nèi)可見(jiàn)嗜酸性物質(zhì)(黃色箭頭)(圖8C)。

A.對(duì)照組；B.滴鼻組；C.注射組

A.對(duì)照組;B.滴鼻組;C.注射組

A.對(duì)照組;B.滴鼻組;C.注射組

3 討論

整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組豬只精神狀態(tài)良好、食欲旺盛，背毛順滑，兩種途徑感染后試驗(yàn)組部分豬只除背毛稍顯粗亂外，健康狀況與對(duì)照組基本一致，未呈現(xiàn)明顯的病態(tài)；有研究表明，分離的野毒株攻毒后仔豬持續(xù)高熱，精神沉郁，食欲不振，被毛粗亂，豬只消瘦后肢無(wú)力[13]。與強(qiáng)毒株相比，本試驗(yàn)中所用的弱毒株的致病力很弱，對(duì)仔豬健康和生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

滴鼻組于感染后3或7 d出現(xiàn)病毒血癥并持續(xù)到15或19 d，27或31 d出現(xiàn)后又迅速消失，拷貝數(shù)一直為103拷貝/μL，在感染后11 d達(dá)到高峰，之后逐漸降低；注射組于感染后3 d出現(xiàn)病毒血癥并持續(xù)到19 d，于31 d也再次出現(xiàn)隨后又迅速消失，感染后11或15 d病毒拷貝數(shù)最高為104拷貝/μL，之后逐漸降低。滴鼻組與注射組相比滴鼻組病毒血癥持續(xù)時(shí)間短且病毒含量低，但兩試驗(yàn)組的病毒血癥都會(huì)在消失后再次出現(xiàn)。43 d時(shí)檢測(cè)仔豬免疫器官及組織病毒拷貝數(shù)時(shí)，頜下、腹股溝淋巴結(jié)PRRSV拷貝數(shù)均可達(dá)103拷貝/μL，PAM中PRRSV拷貝數(shù)可達(dá)到106拷貝/μL。這表明弱毒株感染仔豬后，雖然病毒血癥消失，但病毒仍會(huì)在仔豬體內(nèi)持續(xù)存在。LAMONTAGNE等[14]證實(shí)PRRSV強(qiáng)毒株感染仔豬，豬體內(nèi)能出現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的病毒血癥且病毒在免疫器官和肺臟中持續(xù)增殖。與強(qiáng)毒株相比PRRSV HeN-3弱毒株感染仔豬后其病毒血癥的持續(xù)時(shí)間及病毒載量都比強(qiáng)毒株低，散毒風(fēng)險(xiǎn)更弱。

干擾素(IFN)是體內(nèi)一種重要的干擾病毒繁殖的天然免疫因子，具有廣譜的抗病毒活性。其中最具代表性的是Ⅰ型IFN，即 IFN-α/β。研究表明，Ⅰ型IFN在阻止PRRSV復(fù)制中起重要作用[15-16]。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩試驗(yàn)組都在病毒血癥剛出現(xiàn)時(shí)IFN-α表達(dá)量下調(diào)，在病毒血癥持續(xù)的其他時(shí)間內(nèi)IFN-α表達(dá)量上調(diào)，11 d 后兩組變化趨勢(shì)基本一致，兩組IFN-α表達(dá)量在病毒血癥剛出現(xiàn)時(shí)抑制而后升高，滴鼻組誘導(dǎo)的IFN-α峰值高于注射組；滴鼻組的IFN-α mRNA水平從感染后3 d開(kāi)始升高，7 d降低，11 d又升高，15 d達(dá)到最高水平，19 d后與對(duì)照組趨于相同水平。注射組與滴鼻組變化趨勢(shì)相似，但在 3,11，15 d升高時(shí)段內(nèi)滴鼻組的水平高于注射組。IFN-α的蛋白水平和mRNA變化規(guī)律說(shuō)明 PRRSV HeN-3 弱毒株感染仔豬后可以誘導(dǎo)豬體中 IFN-α產(chǎn)生，而且滴鼻免疫促進(jìn)作用較注射組更強(qiáng)。研究表明，PRRSV 強(qiáng)毒株感染后可能會(huì)通過(guò)干擾 RIG-I、TLR3 和 IPS-1 信號(hào)通路阻抑 IFN-β產(chǎn)生來(lái)抑制IFN-α的表達(dá)量[17]，從而減弱天然免疫應(yīng)答水平，進(jìn)而降低特異性免疫應(yīng)答水平。在 PRRSV 強(qiáng)毒株感染的豬肺臟中幾乎檢測(cè)不到Ⅰ型 IFN[18]，在PRRSV強(qiáng)毒感染 PAM 和 Marc-145 細(xì)胞中Ⅰ型 IFN表達(dá)受到明顯地抑制[19]。與強(qiáng)毒株相比，弱毒株感染能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生一定水平的Ⅰ型IFN-α，顯示弱毒株免疫抑制作用比強(qiáng)毒株弱，對(duì)仔豬有一定的保護(hù)作用。

TNF-α是一種非常重要的炎性因子，其主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，可以作為內(nèi)源性的致熱源促使機(jī)體發(fā)熱，引起細(xì)胞新陳代謝，也可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量白細(xì)胞介素因子，阻斷病毒的復(fù)制和腫瘤的發(fā)生。在PRRSV HeN-3感染后滴鼻組與注射組的TNF-α mRNA水平從3 d開(kāi)始升高，到7 d達(dá)到最高水平，7～15 d時(shí)TNF-α mRNA水平滴鼻組顯著高于注射組，兩試驗(yàn)組在19 d后與對(duì)照組無(wú)明顯差異， TNF-α表達(dá)量在病毒血癥再次出現(xiàn)時(shí)也有所提高，隨著病毒血癥的消失又降至對(duì)照組水平。血清中的病毒拷貝數(shù)高的時(shí)間段與TNF-α的升高趨勢(shì)是相符合的；IL-1β是一種重要促炎性細(xì)胞因子，主要表達(dá)于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，可以全身分泌并循環(huán)作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。試驗(yàn)結(jié)果表明，在3 d時(shí)滴鼻組IL-1β的相對(duì)表達(dá)量比注射組高，滴鼻組在7 d 時(shí)達(dá)到最高并且高于注射組，兩組在19 d后都與對(duì)照組基本處于相同水平。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可以看出滴鼻組的炎性細(xì)胞因子變化趨勢(shì)都提前于注射組。據(jù)報(bào)道，在感染 PRRSV 后，豬體血清、巨噬細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞中的 IL-1β和 TNF-α的表達(dá)量均顯著升高[20-21]，也有報(bào)道顯示，感染 PRRSV 后，豬體血清中的 IL-1β水平在 7～14 d保持較高水平[22]。弱毒株與強(qiáng)毒株相比誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生較低水平的炎性因子，仔豬炎癥反應(yīng)較輕。

病理切片結(jié)果表明，PRRSV HeN-3弱毒株感染仔豬較對(duì)照組的肝臟、脾臟和腎臟只有較輕微的病理變化，而且滴鼻感染組和注射感染組之間無(wú)明顯病理差異。分離的PRRSV野毒株感染會(huì)導(dǎo)致仔豬肝臟表面白色壞死、脾臟腫大、腎臟腫大淤血，病理切片顯示肝細(xì)胞變性，脾小體輪廓不清，巨噬細(xì)胞增生[23]。弱毒株與野毒株相比引起的病變較輕對(duì)仔豬的致病性弱。

PRRSV HeN-3弱毒株無(wú)論以哪種方式感染，都無(wú)明顯的臨床癥狀和病理變化；滴鼻試驗(yàn)組的細(xì)胞因子變化趨勢(shì)要提前于注射組，兩種免疫方式引起的細(xì)胞因子變化趨勢(shì)是相似的。本試驗(yàn)所用弱毒株致病力較弱，病毒血癥持續(xù)時(shí)間較短,炎性細(xì)胞因子水平和炎癥反應(yīng)比強(qiáng)毒株低此外PRRSV HeN-3弱毒株能誘導(dǎo)一定水平的IFN，可以為仔豬提供一定的保護(hù)作用。