表達(dá)IBDV VP2蛋白的基因Ⅶ型重組新城疫病毒的構(gòu)建及鑒定

杜倩茹，王楠楠，任廣彩，葉俊賢，羅 瓊,3，容 芳，何獻(xiàn)銘，王 婷，劉郁夫,，陳瑞愛(ài),*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華農(nóng)(肇慶)生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，廣東 肇慶 526238；3.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東 肇慶 526238)

傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)是一種具有二十面體核衣殼結(jié)構(gòu)的無(wú)包膜雙鏈RNA病毒，感染雞引起急性、高度傳染性、免疫抑制性疾病。IBDV超強(qiáng)毒株感染雛雞，可導(dǎo)致極高死亡率，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前國(guó)內(nèi)主要采用低致病力或中等毒力活疫苗免疫雛雞的方法防控IBDV，但常受母源抗體干擾或流行毒株抗原變異而導(dǎo)致免疫失敗，防控效果不佳[3]。

隨著反向遺傳技術(shù)的不斷成熟與廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者己經(jīng)證實(shí)新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)作為疫苗載體，具有表達(dá)外源蛋白的潛力[4]。NDV作為疫苗載體有以下優(yōu)勢(shì)：NDV基因組在進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄時(shí)呈現(xiàn)“跳躍”式轉(zhuǎn)錄；NDV可在雞胚中快速高效繁殖，生產(chǎn)成本低；NDV可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有一定的免疫佐劑作用[5]。這些特性使NDV成為理想的病毒載體，但先前NDV載體疫苗研究多以基因Ⅱ型疫苗株LaSota為骨架，以近年來(lái)新流行的基因Ⅶ型NDV為載體的報(bào)道較少。

IBDV抗原性主要取決于A片段上VP2基因，其編碼的VP2蛋白是IBDV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[6]。因此本研究通過(guò)反向遺傳技術(shù)，以基因Ⅶ型NDV弱毒株為骨架，在NDV基因組P基因和M基因之間的非編碼區(qū)序列中插入IBDV的VP2基因，獲得表達(dá)IBDV VP2蛋白的NDV重組病毒，為進(jìn)一步研發(fā)NDV和IBDV新型二聯(lián)疫苗提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞系BHK-21、基因Ⅶ型NDV DHN3株全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pBR322-DHN3mF、輔助質(zhì)粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L、pXJ40-DE3由本實(shí)驗(yàn)室保存；9～11日齡SPF雞胚、1日齡和7日齡SPF雞購(gòu)自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的IBDV LYZS株的VP2基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成IBDV VP2基因，并克隆至pUC57質(zhì)粒中。

1.2 主要試劑轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX and Plus Reagent (15338-100)、TRIzol?Reagent (15596-026)購(gòu)自Invitrogen；ClonExpress Multis One Step Cloning Kit (C113)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IBDV-VP2單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 重組質(zhì)粒pBR322-DHNmF-VP2的構(gòu)建本研究在NDV P基因和M基因之間插入外源基因IBDV VP2。具體步驟如下：SmaⅠ酶切質(zhì)粒pBR322- DHN3mF，回收線性片段F1(13 996 bp)做載體備用。以質(zhì)粒pBR322-mFDHN3為模板分別以引物對(duì)FDHN3-F2/R2、FDHN3-SmaⅠ-F3/R3 PCR擴(kuò)增同源重組用DNA片段F2與F3。再以pUC57-VP2質(zhì)粒為模板使用引物VP2-F/R擴(kuò)增IBDV LYZS株的VP2序列，將產(chǎn)物命名為F4片段。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸1 min，循環(huán)34次。引物序列信息見(jiàn)表1。

取上述制備的4個(gè)DNA片段按照物質(zhì)量的比1∶1∶1∶1進(jìn)行混合和同源重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂于氨芐培養(yǎng)皿上進(jìn)行篩選，12～18 h后挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定。

表1 本試驗(yàn)所用的引物序列

1.4 重組病毒rDHN3mF-VP2的拯救將BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，將含VP2基因的NDV全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pBR322-DHN3mF-VP2和輔助質(zhì)粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L和pXJ40-DE3共轉(zhuǎn)染進(jìn)BHK-21細(xì)胞，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后置于-80℃超低溫冰箱保存。將凍存細(xì)胞反復(fù)凍融3次后，取200 μL離心上清液接種9～11日齡的SPF雞胚，4 d后檢測(cè)SPF雞胚尿囊液中HA效價(jià)，將HA≥6 log2的雞胚尿囊液繼續(xù)在SPF雞胚中傳3代。以TRIzol法提取尿囊液中RNA，采用RT-PCR法擴(kuò)增VP2基因插入片段，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 IBDV VP2蛋白表達(dá)的鑒定通過(guò)Western blot試驗(yàn)鑒定rDHN3mF-VP2感染的BHK-21細(xì)胞是否表達(dá)VP2蛋白。將第15代的rDHN3mF-VP2以MOI=1的比例感染BHK-21細(xì)胞，感染后48 h收獲蛋白樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳。以1∶1 000倍比稀釋的IBDV-VP2單抗為一抗，羊抗鼠酶標(biāo)二抗的稀釋比為1∶10 000，用Azure Biosystems C600多功能分子成像系統(tǒng)成像。

通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定rDHN3mF-VP2感染的BHK-21細(xì)胞是否表達(dá)VP2蛋白。將第15代的重組病毒rDHN3mF-VP2以MOI=1的比例感染BHK-21細(xì)胞，感染后48 h，用4%甲醛室溫固定1 h，經(jīng)0.5% TritonX-100透化15 min，37℃溫箱孵育一抗1 h(1∶500稀釋的IBDV-VP2單抗)，37℃溫箱孵育二抗1 h(1∶500稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗)后，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.6 重組病毒rDHN3mF-VP2的部分生物學(xué)特性為驗(yàn)證VP2基因是否能在重組病毒中穩(wěn)定傳代，分別從重組病毒rDHN3mF-VP2的F5、F15、F30代雞胚尿囊液中提取RNA，利用VP2-F/R引物對(duì)，以RT-PCR和測(cè)序的形式檢測(cè)VP2基因在NDV中的穩(wěn)定性，引物序列見(jiàn)表1。

為評(píng)價(jià)VP2基因插入對(duì)NDV毒力的影響，收獲重組病毒rDHN3mF-VP2的第10代SPF雞胚尿囊液，參考OIE標(biāo)準(zhǔn)流程測(cè)定重組病毒和親本株的HA、TCID50、EID50、最小致死量雞胚平均死亡時(shí)間(mean death time,MDT)等病毒毒力指數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

為評(píng)價(jià)重組病毒和親本毒對(duì)BHK-21細(xì)胞的適應(yīng)性，待BHK-21細(xì)胞在6孔板中長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，以MOI=1的比例感染BHK-21細(xì)胞。37℃溫箱孵育2 h后棄去病毒液，換成含有0.01% Trypsin DMEM培養(yǎng)液。感染后4，8，16，24，36，48，60 h收獲感染病毒液，測(cè)定不同感染時(shí)間的病毒TCID50，繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 5.0軟件中t檢驗(yàn)方法對(duì)兩組間數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為兩組數(shù)據(jù)間具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pBR322-DHN3mF-VP2的鑒定以VP2-F和DHN3-SmaⅠ-R3為引物，可擴(kuò)增出大小約2 858 bp的目的條帶，大小與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中的VP2基因序列與模板一致，表明重組質(zhì)粒pBR322-DHN3mF-VP2構(gòu)建成功。

2.2 rDHN3mF-VP2重組病毒的RT-PCR鑒定提取重組病毒尿囊液中病毒RNA，用引物VP2-F/DHN3-SmaⅠ-R3擴(kuò)增重組病毒的VP2基因序列。結(jié)果顯示，瓊脂糖凝膠電泳顯示產(chǎn)物的條帶大小與預(yù)期一致。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列與目的基因VP2序列一致(圖1)。

M.DL8000 DNA Marker;1～2.rDHN3mF-VP2;3.陰性對(duì)照

2.3 rDHN3mF-VP2重組病毒的Western bolt鑒定重組病毒rDHN3mF-VP2感染BHK-21細(xì)胞48 h 后收獲細(xì)胞蛋白，以抗IBDV VP2鼠源單抗為一抗，通過(guò)Western blot檢測(cè)感染細(xì)胞中是否表達(dá)VP2蛋白。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組均能檢測(cè)出40 kDa左右的條帶，與預(yù)期相符，陰性對(duì)照組則沒(méi)有檢測(cè)出目的條帶(圖2)。

M.蛋白Marker;1.陰性對(duì)照;2.陽(yáng)性對(duì)照;3.感染rDHN3mF-VP2的BHK-21細(xì)胞

2.4 rDHN3mF-VP2重組病毒的間接免疫熒光鑒定重組病毒rDHN3mF-VP2感染BHK-21細(xì)胞48 h 后，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)VP2特異性蛋白是否表達(dá)。以抗IBDV VP2鼠源單抗為一抗，通過(guò)熒光顯微鏡觀察感染細(xì)胞中是否能檢測(cè)出綠色熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，而感染了親本株的細(xì)胞和正常細(xì)胞均不能檢測(cè)出綠色熒光信號(hào)(圖3)。

A.感染rDHN3mF-VP2 BHK-21細(xì)胞;B.感染rDHN3mF BHK-21細(xì)胞;C.正常BHK-21細(xì)胞

2.5 rDHN3mF-VP2重組病毒的穩(wěn)定性從重組病毒rDHN3mF-VP2的第5，15，30代雞胚尿囊液中提取RNA，并用引物M-F/P-R對(duì)其進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，3個(gè)代次樣本均能擴(kuò)增出1 985 bp 大小左右的目的條帶，與預(yù)期相符，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明，IBDV的VP2基因可在NDV中穩(wěn)定傳代(圖4)。

2.6 病毒感染BHK-21細(xì)胞引起的細(xì)胞病變?nèi)〉?代病毒rDHN3mF-VP2雞胚尿囊液100 μL、病毒rDHN3-mF雞胚尿囊液100 μL(陽(yáng)性對(duì)照)、SPF雞胚尿囊液100 μL(陰性對(duì)照)分別感染BHK-21細(xì)胞，48 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)(圖5)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，感染重組病毒的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞皺縮、變圓、脫落等細(xì)胞病變，死亡細(xì)胞明顯多于陰性對(duì)照組。

M.DL2000 DNA Marker;1.F5代 rDHN3mF-VP2；2.F15代 rDH-N3mF-VP2；3.F30代rDHN3mF-VP2

A.重組病毒rDHN3mF-VP2感染的BHK-21細(xì)胞；B.親本病毒rDHN3-mF感染的BHK-21細(xì)胞；C.正常的BHK-21細(xì)胞

2.7 rDHN3mF-VP2的毒力指數(shù)測(cè)定參考OIE關(guān)于NDV毒力指數(shù)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)流程，檢測(cè)重組病毒和親本株的HA、TCID50、EID50、MDT。結(jié)果顯示，除了重組病毒rDHN3mF-VP2比親本株rDHN3-mF的HA低1個(gè)滴度外，重組病毒的毒力指標(biāo)TCID50、EID50、MDT與親本株之間均無(wú)顯著差異(表2)。

表2 毒力指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.8 rDHN3mF-VP2的生長(zhǎng)特性分析將重組病毒和親本毒以MOI=1的比例接種BHK-21細(xì)胞，在感染后4,8,16,24,36，48，60 h收獲感染病毒液，測(cè)定不同感染時(shí)間點(diǎn)的病毒TCID50，繪制病毒生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，在感染后4，8，12，24 h，病毒在細(xì)胞內(nèi)不斷復(fù)制，且重組毒rDHN3mF-VP2與原毒株rDHN3-mF均在感染后36 h左右病毒復(fù)制達(dá)到峰值，其后則緩慢下降(圖6)。結(jié)果表明，重組病毒rDHN3mF-VP2與親本株rDHN3-mF在BHK-21細(xì)胞上具有相似的復(fù)制曲線。

圖6 重組病毒與親本株在BHK-21細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線

3 討論

IBDV一直是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要病原，近年來(lái)變異毒株和超強(qiáng)毒株不斷出現(xiàn)導(dǎo)致IBDV的流行情況越來(lái)越復(fù)雜，防控難度越來(lái)越大[7]。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)主要使用的IBDV弱毒活疫苗受母源抗體干擾較大，且存在毒力返強(qiáng)和散毒的風(fēng)險(xiǎn)，因此研制新型疫苗是IBDV研究熱點(diǎn)之一[8]。目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道多種病毒可作為疫苗載體[9-11]，其中較為成功的載體疫苗是重組表達(dá)IBDV VP2蛋白的火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkey，HTV)，在國(guó)外已有商品化疫苗上市，可對(duì)肉雞提供良好的免疫保護(hù)作用[12]。

NDV載體具有較強(qiáng)接受外源基因的能力。李曉芳等[13]用表達(dá)水皰性口炎病毒G基因的重組NDV免疫小鼠，可以誘導(dǎo)顯著的水皰性口炎病毒中和抗體反應(yīng)；田開(kāi)月等[14]構(gòu)建的重組NDV可正確表達(dá)游離形式的4型禽腺病毒Fiber蛋白，并保持親本毒株的低毒力特征和良好的雞胚適應(yīng)性；鄭文卿等[15]以NDV疫苗株為載體，構(gòu)建出共表達(dá)鴨肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)1和3型VP1基因的重組NDV，并且能夠在鴨體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)DHAV-1和DHAV-3的中和抗體，具有成為鴨肝炎重組病毒活載體疫苗的潛力。但先前研究多以NDV經(jīng)典疫苗株LaSota為骨架，而以新流行的基因Ⅶ型NDV為骨架的報(bào)道較少。

NDV不同插入位點(diǎn)影響外源蛋白的表達(dá)效率及重組病毒的生長(zhǎng)特性。ZHAO等[16]在NDV基因組不同位置插入分泌性堿性磷酸酶基因，結(jié)果表明，除了L基因后面非編碼區(qū)，插入到其他位置的重組病毒均能高效表達(dá)外源蛋白，但各重組病毒復(fù)制能力較親本毒株均有不同程度的降低。本試驗(yàn)也獲得相類(lèi)似的結(jié)果，重組病毒rDHN3mF-VP2在雞胚中的繁殖滴度要比親本株低1個(gè)滴度。GE等[17]將AIV的HA基因插入到NDV基因組的P與M之間，獲得的重組毒株可有效抵抗NDV和AIV H5亞型的強(qiáng)毒株攻擊；劉蒙蒙[18]將EGFP和IBV S1基因插入到P基因和M基因之間，也獲得高效表達(dá)的重組病毒。因此綜合考慮靶標(biāo)蛋白的表達(dá)效率和重組病毒的繁殖特性，本研究以NDV基因組中P基因和M基因之間的非編碼區(qū)作為插入位點(diǎn)。

本研究利用成熟的NDV反向遺傳操作系統(tǒng)，成功拯救出重組病毒rDHN3mF-VP2。通過(guò)Western blot和IFA試驗(yàn)證明該重組病毒rDHN3mF-VP2可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性VP2蛋白，并且保持親本株低毒力、遺傳穩(wěn)定、良好的雞胚和細(xì)胞適應(yīng)性等特征。本研究為進(jìn)一步研制新型IBDV和NDV二聯(lián)疫苗奠定了前期基礎(chǔ)，但該重組病毒的安全性和免疫效力仍然未知，接下來(lái)需要利用動(dòng)物模型系統(tǒng)評(píng)價(jià)該重組病毒的安全性和免疫原性。