5/7型豬細小病毒雙重PCR檢測方法的建立

王茂鵬，王偉偉，李 笨，李樂天，魯會軍，金寧一，韓 碩，米志強，李 昌*

(1.溫州大學 病毒學研究所，浙江 溫州 325035；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所 中國醫學科學院人獸共患病毒病防控關鍵技術研究創新單元，吉林 長春 130122；3.遼寧省農業發展服務中心，遼寧 沈陽 110031；4.軍事科學院 軍事醫學研究院 微生物流行病研究所，北京100071)

豬細小病毒(porcine parvoviruses,PPV)為細小病毒科細小病毒屬成員，可引起母豬木乃伊胎、不孕不育及死胎等繁殖障礙性疾病，在世界各地的豬群中均有發現，是造成全球養豬業經濟損失的重要傳染病之一[1-5]。近年來，已發現7個基因型PPV(1～7)，通常用于區分豬細小病毒亞科成員，而這7個基因型PPV根據NS1蛋白序列同源性在細小病毒系統發育樹上又被劃分為Protoparvovirus、Tetraparvovirus、Chapparvovirus和Copiparvovirus4個不同的屬[5-7]。

PPV5和PPV7分別屬于Copiparvovirus屬和Chapparvovirus屬，于2013和2016年才被相繼發現。XIAO等[4]對美國不同年齡段豬群感染PPV5進行的流行病學調查結果顯示，其陽性率達6.6%，略高于PPV4發病率(4.1%)。除美國外，在中國、波蘭和墨西哥等國家也陸續檢出PPV5，PPV5常與PPV4及豬圓環病毒發生共感染，在肺組織內有較高的檢出率，可造成嚴重的仔豬斷奶后多系統衰弱綜合征(post-weaning multi-systemic wasting syndrome,PMWS)[3,8-11]。PPV7亞型細小病毒已經在我國東北三省、廣西省、安徽省等多地檢出。現有文獻表明，PPV5和PPV7共感染加重豬只病情[12-14]，但由于這2個亞型發現時間較短，對共感染病例的檢測尚缺乏有效方法，本研究建立一種針對PPV5/PPV7的雙重PCR檢測方法，并對其進行優化，以期為深入了解PPV共感染對宿主狀態的影響儲備關鍵技術。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器E.coliDH5α感受態細胞、pBM16A載體購自博邁德生物有限公司；LAMP酶、2×Taq DNA Master Mix購自南京諾維贊生物科技有限公司；KOD酶購自日本TOYOBO生物公司；NanoDrop ND-2000C微量核酸檢測儀購自美國Thermo Fisher生物公司；ABI Veriti 96孔梯度PCR儀購自ABI公司。

1.2 引物設計為了同時滿足PPV5/7的特異性檢測和基因組測序分型，以NCBI數據庫中PPV5/7序列NS1基因保守區域為模板(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi GROUP_TARGET=on)設計2對引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 雙重PCR引物序列

1.3 擴增目的片段按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒使用說明書提取病毒核酸，-80℃保存備用。以提取的病毒DNA為模板，用表1中相應的引物分別進行PCR擴增，回收擴增產物連接至pBM16A載體，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，接種LB氨芐抗性液體培養基培養12 h，提取質粒，經通用引物和特異性引物鑒定條帶大小正確后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

1.4 核酸模板定量、稀釋與標準品制備以測序正確的重組質粒作為標準品，用Nano-Drop2000C超微量分光光度計測定濃度后，根據公式[拷貝數=質粒濃度×10-9×6.02×1023/(660×質粒總長度)]將其換算為拷貝數，10倍倍比稀釋成終濃度為1.0×1013～1.0×101拷貝/μL，作為檢測標準品。

1.5 雙重PCR敏感性試驗分別取稀釋至1.0×101～1.0×108拷貝/μL的重組質粒標準品并等體積混合，作為雙重PCR反應模板，用優化后的反應條件進行雙重PCR擴增，以檢測其敏感性。

1.6 雙重PCR反應條件優化建立10 μL反應體系：2×Taq DNA Master Mix 5 μL，2對特異性上、下游引物各0.5 μL，2種重組質粒標準品等比例混合物1 μL，ddH2O補足10 μL。對雙重PCR引物濃度(終濃度為0.10，0.25，0.50，1.00 μmol/L 4個稀釋度)、循環數(25,30，35，40個循環)及酶種類(Taq、LAMP、KOD)等反應條件進行優化。

1.7 雙重PCR特異性試驗采用建立的多重PCR方法，分別以重組質粒標準品等比例混合物和貓細小病毒(FPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)DNA或豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)cDNA為模板進行PCR擴增，評價該方法特異性。

2 結果

2.1 PPV5/7檢測引物設計及系統發育分析如圖1所示，在PPV5和PPV7的NS1基因分別找到2段高度保守序列，經對GC含量和退火溫度優化后設計PPV5(285 F/R)和PPV7(630 F/R)2對引物(圖1A)，其中PPV5(285 F/R)這對引物片段與親緣關系較近的PPV4相差較大，并且可擴增的285 bp 目的片段經Mega7構建Neighbor-Joining系統發育樹(the sum of branch length=1.207 367 31，bootstrap=1 000)后能很好的與PPV4和PPV6區分開，聚類成單獨的支系(圖1B)。在PPV7(630 F/R)這對引物片段與親緣關系較近的PPV6區別較大；同樣的，通過對630 bp片段進行系統發育樹(the sum of branch length=0.492 286 50，bootstrap=1 000)的構建后發現，該片段能夠與PPV4、PPV5和PPV6區分開，聚成單獨的支系，與WANG等[12]、JIN等[15]研究中，根據NS1基因構建的系統發育樹樹形一致[12,15]，符合預期設定。

A.PPV5和PPV7基因組特點及雙重檢測引物設計示意圖;B.PPV5引物保守性及285 bp目的片段系統發育樹的構建;C.PPV7引物保守性及630 bp目的片段系統發育樹的構建

2.2 重組質粒制備構建與驗證挑選3個單克隆，提取質粒，以重組質粒pBM16A-PPV5和pBM16A-PPV7為模板利用表1中引物進行PCR擴增，pBM16A載體通用引物M13F/M13R作為陽性對照。結果顯示，PPV5擴增出約為285 bp目的片段，PPV7擴增出約為630 bp目的片段，結果與預期大小一致(圖2)。pBM16A-PPV5和pBM16A-PPV7測序結果與對應的PPV5和PPV7基因核苷酸序列一致。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.pBM16A-PPV5 PPV5F/R PCR擴增產物;4～6.pBM16A-PPV5陽性對照;7～9.pBM16A-PPV7 PPV7F/R PCR擴增產物;10～12.pBM16A-PPV7陽性對照

2.3 敏感性試驗結果分別將2個重組質粒標準品10倍倍比稀釋成終濃度為1.0×1012～1.0×101拷貝/μL，進行單一PCR反應。再取1.0×101～1.0×108拷貝/μL的2種重組質粒標準品并等體積混合進行雙重PCR反應。結果顯示，單一PCR檢測PPV5下限為10拷貝/μL(圖3A)、PPV7下限為10拷貝/μL(圖3B)，雙重PCR檢測這2種重組質粒標準品下限也為10拷貝/μL(圖4)，表明所建立的雙重PCR敏感性較高。

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～13.101～1012拷貝/μL PPV5(A)或PPV7(B)

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～9.PPV5和PPV7混合質粒101～108 拷貝/μL

2.4 雙重PCR特異性試驗結果應用建立的多重PCR方法，以不同病原DNA或cDNA為模板進行PCR擴增。結果顯示，建立的多重PCR方法僅能擴增PPV5、PPV7基因組DNA，且與預期大小相符，而對FPV、PRV、PEDV、TGEV的核酸均無特異性擴增(圖5)，表明本研究建立的方法特異性較強。

M.DL2000 DNA Marker;1.PRV;2.TGEV;3.PEDV;4.FPV;5.陽性對照

2.5 雙重PCR方法條件優化結果選擇濃度為1.0×105,1.0×106,1.0×107拷貝/μL的混和模板對反應條件進行優化，確定雙重PCR反應的特異性上、下游引物最佳終濃度均為0.5 μmol/L(圖6)。在1.0×103拷貝/μL濃度下對反應循環數進行優化，確定最佳擴增循環數為35個(圖7)。選擇1.0×105，1.0×106，1.0×107拷貝/μL對3種品牌的DNA聚合酶(LAMP、Mix、KOD酶)進行篩選，根據條帶梯度、亮度和成本計算，認為2×Taq DNA Master Mix為該體系的最適檢測用酶(圖8)。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.0.10 μmol/L;4～6.0.25 μmol/L;7～9.0.50 μmol/L;10～12.1.00 μmol/L

2.6 臨床樣品檢測采用建立的多重PCR方法對黑龍江地區9只疑似患病豬的組織樣品進行檢測，其中樣品1，2，5，8為肺組織樣品，3，7為腸組織樣品，4，6，9為脾組織樣品。樣品2，3，6，9和10均檢測到285 bp目的條帶，樣品1，2，4和5檢測出630 bp 目的條帶，表明2，3，6和9號豬都感染PPV5，而1，2，4和5號豬感染PPV7，其中2號豬為PPV5和PPV7混合感染。

M.DL2000 DNA Marker;1～4.循環數為25,30,35,40

M1～M3.DL2000 DNA Marker;1～3.LAMP酶;4～6.Taq酶;7～9.KOD酶

M.DL2000 DNA Marker;1～9.對應豬臨床樣品;10.陽性對照;11.陰性對照

3 討論

近年來在我國貴州、湖南、廣東、安徽和福建等地區均有PPV7、PPV5感染的病例[13]。PPV與PRV、豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬圓環病毒2型和豬瘟病毒相比，其妊娠母豬臨床癥狀不明顯，不容易引起養殖戶的注意，而此類病毒能與其他病原混合感染，嚴重的可導致豬只死亡或變成僵豬，為臨床診斷帶來困難[16]。目前主要診斷方法有：病毒分離、血凝抑制試驗和乳膠凝集試驗等，其中血凝抑制試驗相對簡便，但由于要制備豚鼠紅細胞以及被檢血清必須經高嶺土或其他方法處理而顯得麻煩；乳膠凝集試驗靈敏度不高，尤其是對隱性感染動物往往漏檢；病毒分離和鑒定結果準確可靠，但是該方法費時費力，并且需要一定的技術條件和設備；PCR及熒光定量PCR診斷具有靈敏度高，特異性強，快速、簡便等優點已成為診斷PRV的研究熱點[17]。本試驗所建立的PPV5、PPV7雙重PCR，能在1次反應中對這2種病原體引起的傳染病進行核酸診斷且特異、敏感、快速、簡便，利于防止該病蔓延擴散，減少經濟損失，對豬場凈化病原具有潛在的應用前景。

PPV病毒粒子無囊膜，直徑約20 nm，基因組為單股DNA，大小4.0～6.3 kb，2個末端序列形成復雜的回文發夾結構，全基因組包含2～3個主要的開放閱讀框架，由5′端UTR、非結構蛋白(NS1)、結構蛋白(Cap)和3′端UTR組成。PPV5的衣殼蛋白(VP1)中存在Ca2+結合環(YXGXG)和磷脂酶A2(PLA2)催化中心的HDXXY保守基序，包括D63，據報道這是PPV進入和感染的先決條件[4]。PPV具有高替換率(每年10-3～10-5替換/位點)進化，且屬內的核苷酸替換速率也有不同的特點，PPV7的NS1和Cap蛋白基因的核苷酸突變率高于PPV1～PPV4，揭示PPV的遺傳異質性，可能是病毒適應各種環境條件的有效方法[18]。

本研究根據PPV 2個亞型的保守基因設計不同長度目的片段的特異性引物，擴增到285(PPV5)，630 bp(PPV7)2段目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳直接判定擴增結果，更直觀和實用，且對以上2片段進行系統發育分析時，可以準確聚集在同一支系上，利于降低結果假陽性，并開展初步的病毒溯源工作。經多個試驗條件優化結果表明，25次循環時模板濃度較低時無條帶，30～35次循環時有條帶，條帶清晰穩定。使用LAMP酶時目標條帶微弱甚至無目標條帶，雖然KOD酶擴增的條帶清晰但其價格昂貴，綜合這2個因素，使用2×Taq DNA Master Mix最為合適。經體系優化后，雙重檢測體系檢測下線達到了單一檢測的靈敏度，為10拷貝/μL，可應用豬群的一般檢測工作。此外，本研究設計的引物可以特異性檢測PPV5/7，不受其他豬源病毒(如PRV、TGEV和PEDV)的干擾，而且也無法檢測到同屬的貓細小病毒(FPV)。隨機對2020年期間收集的黑龍江地區9頭病豬的不同組織樣品檢測發現，存在1例共感染現象，PPV5和PPV7感染比例44.4%(4/9)。結果表明，本研究所開發的檢測方法，具有臨床應用價值，可在后續大群篩查中得以應用。