天然食品防腐劑的抑菌機理研究進展

朱燕莉，王正莉，王衛(wèi)，吉莉莉，張佳敏，白婷，趙志平，侯薄，陳林

(成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106)

世界范圍內，有大約40%的食品腐敗變質都是由微生物引起的，其中細菌和霉菌是導致食品腐敗變質、品質下降的主要原因。為防止或延緩食品品質下降，除了傳統(tǒng)的罐藏、冷凍、鹽漬等保藏方法以外，使用食品防腐劑也是延長食品保質期非常普遍的方式。但越來越多的研究表明，有些化學添加劑具有致畸性、誘癌性等潛在的危害。考慮到化學合成防腐劑在使用過程中的安全局限性，天然抗菌物質因其安全、高效、廣譜等特性逐漸成為研究熱點，被廣泛應用在食品、醫(yī)藥等領域。本文主要介紹了存在于植物、動物和微生物中的天然物質抗菌成分的抑菌機理以及目前國內外的研究進展。

1 抗菌物質的研究現(xiàn)狀

1.1 化學合成防腐劑

食品在加工和貯藏過程中的腐敗變質現(xiàn)象是食品行業(yè)面臨的主要問題之一，目前普遍使用的抗菌物質是化學合成防腐劑，如山梨酸鹽、亞硝酸鹽和苯甲酸鹽等，大多數(shù)化學防腐劑對人體有潛在的危害。Mamur等[1]研究發(fā)現(xiàn)，山梨酸鈉對人體外周血淋巴細胞(PBL)有一定的基因毒性，并且山梨酸鹽容易與蛋白質反應產生絡合物，對人體也有潛在的毒害作用。多種防腐劑不宜共同使用，有報道稱，在肉制品中，山梨酸鹽和亞硝酸鹽的共同使用存在形成誘變化合物的風險，不利于人體健康，在生產和加工中應該盡量減少使用[2]。

1.2 具有抗菌性的天然物質

隨著居民飲食安全意識的不斷提高，具有抗菌成分的天然物質受到社會各界的廣泛關注，逐漸成為食品行業(yè)研究開發(fā)和廣泛應用的熱點。天然抗菌物質具有抗菌性強、熱穩(wěn)定性好和安全高效等優(yōu)點，其主要來源于植物、動物和微生物，常見的有肉桂酸、溶菌酶、殼聚糖和乳酸鏈球菌素(Nisin)等，其中肉桂酸是酚類物質，酚類物質一般具有抗菌、抗氧化、抗褐變、防止酸敗等作用，應用更加廣泛，而非酚類物質，如大豆球蛋白堿性抗菌肽、糖醇類脂肪酸酯和蒜素等，主要表現(xiàn)出抗菌性。安全穩(wěn)定的天然防腐劑可大大提高食品的品質，更好地維護人體健康。目前天然抗菌物質商業(yè)化應用的局限性在于機制和原理的探究較少，提取、分離和純化等步驟繁雜，技術要求較高，且源于植物的天然物質有明顯的季節(jié)性，在提取工藝中也需要加以考慮和調整。因此，探究抑菌機理是天然抗菌物質提取工藝優(yōu)化和廣泛應用的重要基礎。

2 不同來源的天然物質抑菌機理

2.1 植物提取物

很多來源于植物的成分可作為天然抑菌物質使用，如肉桂、丁香、迷迭香、辣椒等物質的提取物，它們都具有很強的殺菌作用，可加工為天然防腐劑在食品中使用，有些也被制作為植物精油。

2.1.1 肉桂酸和肉桂醛

桂枝提取物可有效抑制菌體孢子的萌發(fā)，使細胞膜結構被破壞，膜的通透性增加，胞內電解質外泄，細胞結構的穩(wěn)定性和菌體的物質代謝被影響、擾亂，導致菌絲無法正常發(fā)育繁殖，甚至致死。

肉桂酸的主要抑菌機理是抑制菌體的孢子萌發(fā)，破壞細胞膜結構，擾亂其物質代謝，并影響三羧酸循環(huán)(TCA)的過程，使菌體的能量代謝途徑受到不同程度的阻礙，從而達到抑菌殺菌的效果。王秋亞等[3]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂酸能夠破壞菌體表面的磷脂雙分子層，使得細胞膜的通透性增強，導致胞內滲出大量的電解質，增加胞內液體的電導率，蛋白質及其糖類隨之減少，菌體結構的穩(wěn)定性從而遭到破壞，其物質代謝過程被擾亂，致使菌絲無法正常生長發(fā)育。遭到破壞的菌絲往往呈畸形，表面常有皺縮、膨大的現(xiàn)象出現(xiàn)，菌絲扭結纏繞在一起或者斷裂。謝麗玲等[4]研究表明，肉桂酸對菌體的呼吸代謝作用也可產生較大影響，對于能量代謝相關酶如琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)有較好的抑制效果，使氧化磷酸化過程以及電子能量傳遞等代謝途徑受阻，從而影響、阻礙菌體生長，最后致使菌體死亡。在實際應用中將肉桂酸與巴氏殺菌助劑復配，能夠顯著增強殺菌防腐效果。

肉桂醛(C9H8O)是一種醛類有機化合物，大量分布于肉桂等植物體內。由于其分子結構為一個丙烯醛與一個苯基相連，因此被認為是丙烯醛的一種衍生物，自然界中存在的肉桂醛均為反式結構。

Shreaz等[5]研究表明，肉桂醛的抑菌機制不僅僅是單方面起作用，而是通過很多方面影響微生物的正常發(fā)育和代謝，并且不同濃度的肉桂醛對細菌細胞的抑制機理有差異，彼此間呈現(xiàn)劑量-效應關系。高濃度的肉桂醛通過對細菌細胞膜脂肪酸的分布產生影響，從而抑制酶活性，改變細胞膜的流動性，滲透作用增強的同時，細胞內物質外滲，導致菌體死亡；中等濃度的肉桂醛通過影響細胞內三磷酸腺苷(ATP)蛋白酶，抑制其活性，細胞內能量供應途徑受阻，生物膜的合成遭到破壞，從而起到抑菌作用；低濃度的肉桂醛與菌體細胞內的物質相結合，如蛋白質、激素等因子，影響細胞的正常分裂，抑制菌體細胞的生長繁殖，從而達到抗菌的效果。

He等[6]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛能夠深入滲透到菌體細胞的內部，與細胞內DNA發(fā)生作用，阻礙DNA的正常合成。此外，還有一些研究表明，肉桂醛能夠改變細菌內部的離子(Ca2+、K+和H+等)平衡，從而使細菌細胞死亡。

2.1.2 大豆球蛋白堿性抗菌肽(GAP)

抗菌肽原指昆蟲體內經過誘導而產生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質。自然界中的抗菌肽可分為植物抗菌肽、細菌抗菌肽和昆蟲抗菌肽等若干種，幾乎存在于所有生命體中。馮林慧等[7]在天然防腐劑的研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)抗菌肽來源于食物本身，例如GAP就是從豆粕中提取出來的一種植物來源的陽離子肽，它具有廣譜抑菌的特性，且不會對人體健康產生危害和毒副作用。關于抗菌肽的殺菌抑菌機理，現(xiàn)在普遍的觀點是膜損傷機理和膜內物質損傷機理。

膜損傷機理認為，抗菌肽通常作用于菌體細胞膜。Dean等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有陽離子特性和兩親性，當抗菌肽接觸細胞膜時，彼此識別聚集到一起，在靜電作用的吸引下，抗菌肽與帶負電的磷脂細胞膜相結合，疏水基團進入細胞膜深處的疏水層，疏水端暴露，細胞膜的通透性發(fā)生改變，其結構和完整性也遭到破壞，胞內物質泄露，膜電位隨之降低，細胞的能量代謝過程被影響，生存能力受到威脅，嚴重時導致細胞死亡。

關于膜內物質損傷機理的研究和報道很少。抗菌肽不僅可以破壞細胞膜，還可以損害細胞內核酸和蛋白質等大分子物質，進而影響菌體細胞的代謝等正常生理活動。研究發(fā)現(xiàn)，有些抗菌肽能與大腸桿菌的DNA結合，改變其結構，從而影響菌體細胞的正常生理功能，但是大腸桿菌的細胞膜不會遭到明顯的破壞。

大豆球蛋白堿性抗菌肽(GAP)是陽離子型抗微生物肽，GAP通過改變細菌細胞膜的通透性，使細胞內鈣、鉀離子泄露至細胞外，引起細胞局部結構發(fā)生改變形成細槽，從而導致細胞的塌陷。研究表明，GAP可明顯抑制大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等。

GAP能夠破壞單增李斯特氏菌的細胞形態(tài)，影響其生理代謝。首先，Vidal等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，GAP通過自身所帶的正電荷中和單增李斯特氏菌表面所帶的負電荷，引起電勢差的減小，菌體細胞膜出現(xiàn)去極化現(xiàn)象，從而使細胞膜的完整性遭到破壞。其次，GAP對單增李斯特氏菌細胞膜的作用使其通透性發(fā)生改變，進一步導致細胞內物質的泄露，致使DNA遭到破壞，隨之降解。此外，GAP可以抑制單增李斯特氏菌呼吸鏈脫氫酶和ATP酶的活性。最后，GAP也可以通過影響菌體細胞呼吸代謝途徑中的EMP途徑，使菌體的呼吸代謝遭到抑制和破壞[10]。

GAP對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌活性。Yang等[11]研究表明，GAP會嚴重破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜，導致細菌膜的滲漏和胞內物質的流出。此外，GAP能夠抑制金黃色葡萄球菌非特異性酯酶和ATP酶的活性，擾亂細菌正常的生長和繁殖。對于金黃色葡萄球菌來說，GAP的抑菌活性取決于其對細胞膜的破壞程度以及胞內活性氧的產生劑量。GAP誘導細菌活性氧的產生，而產生的活性氧則會使菌體出現(xiàn)不同程度的氧化應激反應。Aruldass等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，低劑量的活性氧可減輕細胞損傷，而高劑量的活性氧則會使一些細胞大分子物質如蛋白質、DNA等變性和降解，細胞的結構和細胞內介導的功能遭到破壞，從而導致活性氧介導的細菌細胞凋亡，達到抗菌效果。

2.2 動物提取物

來源于動物的抑菌提取物是指主要從與動物相關的物質中提取得到的具有天然抗菌成分的物質，如魚精蛋白、殼聚糖和動物型溶菌酶等。

2.2.1 溶菌酶

溶菌酶(Lysozyme)是一種水解酶類，可專門作用于微生物的細胞壁。它是由18種、129個氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質，可以分解N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)殘基之間的β-1,4糖苷鍵，是許多生物先天免疫系統(tǒng)的重要組成成分。溶菌酶作為一種天然抗菌物質，由于可在腸胃內被消化吸收，不會危害人體健康，因此被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和飼料等領域。

人們普遍認為，溶菌酶的抑菌機理主要是通過破壞微生物的細胞壁，對細菌骨架物質——聚糖的降解反應進行催化，從而導致菌體細胞裂解而死亡。

根據(jù)溶菌酶作用對象的不同和菌體細胞壁成分的不同，可將其分為細菌型細胞壁溶菌酶和真菌型細胞壁溶菌酶。對于細菌來說，溶菌酶主要作用于兩個部位：一是肽聚糖的β-1,4糖苷鍵處；二是肽鏈的酰胺部分和“尾”端。Yu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，C型溶菌酶主要存在2個結構域，高度保守的天門冬氨酸52和谷氨酸35殘基組成其催化位點，與肽聚糖底物在裂縫內深處結合，NAM和NAG之間的糖苷鍵遭到破壞，從而導致細菌的裂解死亡。對于真菌來說，溶菌酶的主要作用對象為酵母細胞壁的β-1,3-D-葡聚糖、β-1,6-D-葡聚糖、甘露聚糖和霉菌細胞壁的殼多糖，它對于酵母菌和霉菌有一定的溶解作用。由此，溶菌酶發(fā)揮作用的特異性很強，菌種不同，作用的底物和部位也會有差異。

由于溶菌酶能夠專門作用于菌體細胞壁，而不會影響干擾細胞其他部位，革蘭氏陽性菌的細胞壁約90%都是肽聚糖組成的，因此溶菌酶對革蘭氏陽性菌的抑制效果十分顯著。此外，溶菌酶對于枯草芽孢桿菌有極其顯著的分解作用，對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌也有溶解作用。

溶菌酶對微生物細胞壁的破壞并不是它抑菌的唯一機制，研究表明，溶菌酶能夠迅速增加大腸桿菌外膜的滲透性，使外膜形成孔洞結構，對大腸桿菌的內膜也具有直接的抑制作用[14]。

2.2.2 殼聚糖

殼聚糖(Chitosan)的分子式為(C6H11NO4)n。其天然儲備量較為豐富，常來源于蟹蝦、昆蟲等動物硬殼。殼聚糖是一種天然堿性多糖物質，通過脫乙酰化反應從甲殼素中提取，因其具有無毒、可降解、抗微生物等優(yōu)良特性，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和工業(yè)降解等領域。

國內外學者對殼聚糖的抗菌機制做了大量實驗與研究驗證，目前被廣泛認可的機理有以下4種：

第一，殼聚糖的抗菌活性源自其氨基(NH2)所帶的正電荷(NH3+)。Costa等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，當pH

第二，Obianom等[17]通過研究殼聚糖對不同酶基因的表達，發(fā)現(xiàn)其分子降解的產物可以經過多層相互交聯(lián)的細胞壁屏障到達細胞內部，干擾細胞內DNA，抑制蛋白質和mRNA等物質的合成，導致基因表達發(fā)生變化，關鍵酶的活性降低，影響微生物的正常生長和代謝。

第三，Sebti等[18]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖還具有螯合金屬離子的能力。當pH>pKa(6.3)時，殼聚糖能夠非常好地吸收螯合金屬陽離子，同時作用于帶有陰離子的細胞膜，從而改變細胞膜的滲透性，使菌體表面形態(tài)被破壞，導致細胞內物質泄漏。

第四，根據(jù)其聚合成膜的特性，殼聚糖還可以形成一層不透氣的涂膜來抑制微生物生長。該膜阻止營養(yǎng)物質進入細胞的同時也阻止了O2的進入，從而起到了抑制好氧型微生物生長繁育的作用。

但是，殼聚糖在中性和堿性條件下的抗菌效果不如酸性環(huán)境條件下的。對此，有學者對殼聚糖的改性進行了研究，如殼聚糖交聯(lián)改性、殼聚糖酰基化改性和殼聚糖酯化改性等，有望提高其抑菌性能。

2.3 微生物類抗菌物質

微生物類抗菌物質是一類具有抑菌活性的物質，由微生物生長代謝產生， 主要包括多肽和有機酸等。這些物質分子量小，結構緊密，能夠輕易進入到細胞內部，可以較好地抑制一些微生物的生長繁殖。

乳酸鏈球菌素(Nisin)是由乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)產生的一類兩親性陽離子多肽。在代謝過程中，通過核糖體的相關合成機制產生具有殺菌效果的多肽或蛋白，Nisin的化學式為C143H230N42O37S7，由34個氨基酸殘基組成。它對革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌的孢子均具有強烈的抑制作用，是目前世界上唯一允許被用作食品添加劑的細菌素。

與傳統(tǒng)抗生素相比，Nisin的抑菌機制十分獨特。章銀良等[19]在防腐劑抑菌性能的研究中發(fā)現(xiàn)，Nisin主要作用于繁殖體的細胞膜，阻礙細胞膜磷脂化合物的合成途徑，使硫氫基團的活性降低甚至失去活性，造成細胞膜功能的損害，從而導致了細胞的裂解，胞內物質泄露，同時也抑制了細菌細胞壁中肽聚糖的合成。Bauer等[20]研究認為，Nisin對菌體的抑制作用主要是在于脂II(Lipid-II)分子結合的過程中形成孔洞復合物，這種Nisin-Lipid-II孔洞復合物能夠在納摩爾級的濃度下對細胞膜造成損害，例如在膜上穿孔，胞內氨基酸、ATP和離子的泄露等，最后導致菌體死亡。脂Ⅱ分子在細菌細胞壁合成的過程中起著非常重要的作用，是一種不可或缺的中間體。因此，Nisin與脂II分子的結合會嚴重干擾細胞壁的合成，從而起到抑菌的作用。在實踐中，高溫滅菌與Nisin同時搭配使用，能夠大幅度提升此效果。

Nisin對于芽孢的抑制作用主要是在芽孢萌發(fā)的前期破壞它的膜結構，抑制其發(fā)芽，而不是殺死芽孢。但是Nisin對革蘭氏陰性菌的作用不大，對酵母菌和霉菌幾乎沒有任何影響，可能的原因是革蘭氏陰性菌細胞壁中含有的脂多糖在對抗Nisin時發(fā)揮了屏障作用，有效阻擋了Nisin對細胞膜的破壞。在取代化學添加劑的可能性方面，實驗證明，不同質量分數(shù)的Nisin、殼聚糖和植物提取物復配，在川菜中的抑菌效果與添加一定量的山梨酸鉀相當，能夠有效抑制微生物的生長繁殖，甚至作為天然防腐劑代替山梨酸鉀。同時，Nisin也可參與發(fā)酵過程，在白酒發(fā)酵過程中適當加入Nisin，可有效抑制白酒中乳酸菌的生長，在醬油中加入Nisin也能夠抑制一些特定菌種的生長繁殖，使醬油的品質得以提升[21]。

3 不同天然物質的抑菌效果

不同天然物質抗菌成分的抑菌機理可以分為以下幾種：

(1)對菌體細胞壁或者細胞膜結構的破壞，破壞其屏障功能，使胞內物質泄漏；

(2)作用于細胞內部的核酸和蛋白質等物質，影響其表達和合成，使細胞喪失生長的物質基礎；

(3)抑制菌體內能量相關酶的活性，使其代謝過程受阻，影響細胞的呼吸作用和正常生長。

以上若干種天然抗菌物質中，肉桂酸和肉桂醛對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有明顯的抑制作用，此外，肉桂酸抑制真菌的效果最好。大豆球蛋白堿性抗菌肽(GAP)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌均具有明顯的抑制效果。溶菌酶對革蘭氏陽性菌的作用效果十分顯著，對革蘭氏陰性菌僅有一定的溶解作用，效果較弱，研究發(fā)現(xiàn)，溶菌酶和Nisin對革蘭氏陽性菌具有協(xié)同作用。殼聚糖對細菌、真菌甚至病毒都有較好的抑制效果，但是殼聚糖的水溶性很差，只能少量地溶解于稀酸溶液，抗菌能力較溫和。乳酸鏈球菌素(Nisin)對革蘭氏陽性菌的抑制效果非常顯著，對酵母菌和霉菌幾乎沒有明顯的作用，最近研究表明，Nisin聯(lián)合EDTA一起使用，對沙門氏菌和革蘭氏陰性菌也有較為明顯的抑制作用。

4 結語

我國天然物質資源豐富，目前雖然已經開發(fā)出數(shù)十種天然防腐劑，但實際能夠高效投入使用的并不多，在對天然抑菌物質的開發(fā)和應用方面仍然存在許多問題：

(1)植物型抗菌物質有明顯的季節(jié)性和地域性，分離和提取工藝受到諸多限制；

(2)天然抗菌物質的作用機理和抗菌譜的研究不夠明了；

(3)缺乏對天然提取物純品的毒理學評價；

(4)研究開發(fā)和投入使用的成本過高。

探究天然抗菌物質的抑菌機理，并對其進行改進、復配或者工藝優(yōu)化，對今后在食品生產加工領域的廣泛應用，減少甚至替代使用化學合成防腐劑具有重大意義，對后續(xù)的相關研究和課題也提供了新的思路和應用價值。