高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵動力學研究

劉明，伍時華，龍秀鋒*，易弋，曾令杰

(1.廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

甘蔗是一種廉價高產(chǎn)的作物，在廣西有著得天獨厚的優(yōu)勢[1]。它的主要成分是水、蔗糖、無機物等，它又是制取白砂糖的主要原料[2]，其副產(chǎn)物甘蔗糖蜜主要用于生產(chǎn)酒精。蔗糖乙醇發(fā)酵的實質是蔗糖先被酵母分泌的蔗糖水解酶在胞外水解為果糖和葡萄糖，然后果糖和葡萄糖在酵母細胞內經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸，進而生成乙醇，后續(xù)加工提純?yōu)楣I(yè)酒精或燃料乙醇[3-4]。目前對甘蔗汁和甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵的研究多集中于甘蔗糖蜜預處理、發(fā)酵菌種篩選、工藝優(yōu)化等方面[5-9]，但是很少有對蔗糖乙醇發(fā)酵過程酵母生長、乙醇生成、基質消耗動力學規(guī)律方面的研究。

發(fā)酵動力學是研究菌體生長、底物消耗、產(chǎn)物生成之間的動態(tài)定量關系[10-11]，建立相應動力學方程的數(shù)學模型，從而達到認識發(fā)酵過程規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵工藝、提高發(fā)酵產(chǎn)量、預先估計含量變化的目的，為補料發(fā)酵、放大實驗提供了理論基礎[12-13]。模擬發(fā)酵過程的模型有很多種[14-17]，大多數(shù)人采用的是非結構模型或經(jīng)驗模型，Zakeri等[18]利用非結構模型建立動力學方程可以成功預測甘蔗糖蜜生產(chǎn)黃原膠的發(fā)酵過程，為黃原膠的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎。為了能夠利用簡單數(shù)學模型表示復雜的發(fā)酵過程曲線，本文重點研究高濃度(260 g/L)蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程中酵母生長、乙醇生成、總糖消耗情況，利用Logistic方程和Luedeking-Piret-like方程擬合實際發(fā)酵過程中的數(shù)據(jù)，并對模型擬合情況進行分析，找到能預測發(fā)酵過程的動力學方程，對甘蔗糖蜜和甘蔗汁高濃度乙醇擴大生產(chǎn)有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母GJ2008(Saccharomycescerevisiae)：由廣西科技大學發(fā)酵工程研究所保藏，適用于高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L)

一級種子培養(yǎng)基：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，自然pH(50 mL三角瓶裝液量30 mL)；二級種子培養(yǎng)基：葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨20，pH自然(500 mL三角瓶裝液量300 mL)；蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖260，酵母粉10，蛋白胨20，pH自然(5 L發(fā)酵罐裝液量3 L)。以上培養(yǎng)基均使用高壓蒸汽在115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑及儀器

蔗糖：市售，生產(chǎn)于廣西；硫酸(AR)：西隴科學股份有限公司；葡萄糖、果糖(AR)：天津科密歐化學試劑有限公司；乙腈、乙醇(AR)：安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司；酵母粉、蛋白胨(BR)：廣東環(huán)凱微生物科技公司。

SQP電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；Chormaster高效液相色譜儀、Himic大容量冷凍離心機 日本Hitachi公司；Biotech-5BG×5-94005L發(fā)酵罐 上海保興生物設備公司；LDZH-100KBS立式壓力滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BX43生物顯微鏡 奧林巴斯有限公司；ZWYR-C2402觸控搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法

取1環(huán)斜面菌體至一級種子培養(yǎng)基，在搖床32 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 h后離心去上清液，加無菌水制成10倍濃縮一級種子菌懸液。將10倍濃縮一級種子菌懸液3 mL接至二級種子培養(yǎng)基，在搖床32 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)8 h后離心去上清液，加無菌水制成10倍濃縮二級種子菌懸液。

1.2.2 發(fā)酵方法

將30 mL 10倍濃縮二級種子菌懸液接至5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，在轉速150 r/min、溫度32 ℃、通氣量80 mL/min條件下，進行微通氧發(fā)酵；從0 h開始，每隔3 h取一次發(fā)酵液進行測定，設置2組平行，結果取平均值。

1.3 檢測分析方法

酵母細胞數(shù)的測定：取發(fā)酵液樣品用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，充分振蕩并采用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下計數(shù)。

液相色譜檢測糖條件：色譜柱為Alltima Amino(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流動相為乙腈∶超純水為80∶20(V/V)，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL。總糖=蔗糖×1.05+果糖+葡萄糖。

液相色譜檢測乙醇條件：色譜柱為Lachorm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動相為5 mmol/L硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，進樣量為20 μL。

1.4 發(fā)酵動力學模型求解

通過蔗糖發(fā)酵試驗得到酵母生長、乙醇生成、總糖消耗隨時間變化的曲線，以Logistic方程描述酵母生長及乙醇生成隨時間變化的曲線，以Luedeking-Piret-like方程描述總糖消耗過程。利用Origin 9.5軟件繪圖并對這3項的檢測數(shù)據(jù)進行非線性擬合，采用Levenberg-Marquardt算法和全局優(yōu)化算法獲得參數(shù)，并求出帶有具體參數(shù)的動力學方程。

2 結果與分析

2.1 蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程中酵母數(shù)、乙醇濃度和總糖含量的變化

按照1.2.2中的發(fā)酵方法對蔗糖進行乙醇發(fā)酵，并對發(fā)酵過程中的酵母數(shù)、乙醇濃度進行檢測和對總糖含量進行計算，結果見圖1。

圖1 260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程Fig.1 The batch fermentation process of ethanol with 260 g/L sucrose

由圖1可知，在接種二級濃縮菌懸液后，酵母菌的生長過程變化可分為兩個階段，0～15 h為快速生長期，酵母數(shù)呈線性增加，生長速率較快；15 h后進入穩(wěn)定期，酵母數(shù)趨于平緩，酵母數(shù)最大達4.23×108個/mL。乙醇含量隨著菌體生長而增加，說明產(chǎn)物生成與菌體生長屬于“生長偶聯(lián)型”，0～6 h乙醇增加得比較緩慢，6 h之后酵母細胞產(chǎn)生乙醇能力開始增加，乙醇濃度快速增加，在27 h時乙醇濃度趨于平緩，39 h發(fā)酵結束，終乙醇量為111.17 g/L。總糖消耗趨勢與乙醇大致相同，0～6 h之間總糖消耗緩慢，期間減少的糖主要用于菌體生長，在6 h之后糖消耗加快，乙醇快速增加，二者有很大的相關性，33 h殘總糖趨于平緩，發(fā)酵結束時殘總糖為17.86 g/L。

2.2 發(fā)酵動力學模型的建立和求解

2.2.1 酵母生長動力學模型

Logistic方程是由比利時學者Verhulst提出的一種“S”形曲線，此方程在擬合分批發(fā)酵中酵母生長很實用，能較好反映發(fā)酵過程中酵母增加對自身生長的抑制作用[19]，方程如下：

(1)

式中：x為酵母濃度，×108個/mL；xm為最大酵母濃度，×108個/mL；μm為最大比生長速率，h-1；t為發(fā)酵時間，h。將式(1)積分：

將x∈(x0, xt)，t∈(0, t)對上式積分得：

(2)

利用軟件將式(2)進行自定義擬合，代入圖1數(shù)據(jù)后得到酵母生長動力學曲線，見圖2，其相關參數(shù)及方差分析表見表1和表2。

圖2 酵母生長試驗值擬合曲線Fig.2 The fitting curve of yeast growth test values

表1 參數(shù)估計值(菌體生長)Table 1 The parameter estimates (cell growth)

表2 方差分析(菌體生長)Table 2 The analysis of variance (cell growth)

由圖2可知，曲線在酵母快速生長期時擬合度較好，但是在平穩(wěn)期時可能由于取樣的原因導致測定值有高有低，擬合度沒有快速生長期好。由表1和表2可知，酵母擬合曲線的均方根誤差為0.134，相關系數(shù)R2為0.9915，F(xiàn)值為3135.719，說明擬合結果較好，此模型可以較好反映260 g/L蔗糖酒精發(fā)酵過程中酵母的生長變化。

2.2.2 乙醇生成動力學模型

乙醇生成模型同樣屬于“S”形曲線，本試驗乙醇生成動力學模型仍采用Logistic方程進行預測模擬。

(3)

式中：p為乙醇質量濃度，g/L；pm為乙醇最大質量濃度，g/L；μn為最大比生成速率，h-1；t為發(fā)酵時間，h。將式(3)積分得：

將p∈(p0, pt)，t∈(0, t)對上面公式積分得：

(4)

利用軟件將式(4)進行擬合，代入圖1數(shù)據(jù)后得到乙醇生成動力學曲線，見圖3，其相關參數(shù)及方差分析表見表3和表4。

圖3 乙醇生成試驗值擬合曲線Fig.3 The fitting curve of ethanol generation test values

表3 參數(shù)估計值(乙醇生成)Table 3 The parameter estimates (ethanol generation)

表4 方差分析(乙醇生成)Table 4 The analysis of variance (ethanol generation)

由圖3可知，在6 h之前擬合效果不好，預測值始終高于測定值，甚至在95%置信區(qū)間之下，結合圖2的酵母生長擬合曲線，說明在高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程的前期主要是細胞生長，乙醇生成很少。但在9 h之后乙醇生成量開始快速增加并且在33 h趨于平緩，可知在酵母穩(wěn)定期也有相當一部分乙醇生成。由表3和表4可知，乙醇生成擬合曲線的相關系數(shù)為0.9940，均方根誤差為4.044，F(xiàn)值為1672.07，雖然9 h之前的乙醇生成量比預測值低，但是總體的擬合趨勢良好，說明此方程能大致反映260 g/L蔗糖酒精發(fā)酵過程中乙醇的生成變化。

2.2.3 總糖消耗動力學模型

總糖消耗包括3個方面：用于酵母生長及合成；作為酵母自身呼吸代謝；用于產(chǎn)生乙醇[20]。在蔗糖乙醇發(fā)酵中根據(jù)總糖消耗的碳平衡，結合酵母生長和乙醇生成的動力學模型，得到總糖消耗動力學模型。其模型如下：

(5)

式中：s為總糖濃度，g/L；x為酵母濃度，×108個/mL；p為乙醇濃度，g/L；ms為細胞的維持系數(shù)，h-1；Yx/s為酵母相對于總糖的得率系數(shù)，108個/g；Yp/s為乙醇相對于總糖的得率系數(shù)，g/g；將式(5)積分得：

將s∈(s0, st)，x∈(x0, xt),t∈(0, t)對上面公式積分得：

(6)

利用軟件將式(6)進行擬合，代入圖1數(shù)據(jù)后得到總糖消耗動力學曲線，見圖4，其相關參數(shù)及方差分析表見表5和表6。

圖4 總糖消耗試驗值擬合曲線Fig.4 The fitting curve of total sugar consumption test values

表5 參數(shù)估計值(總糖消耗)Table 5 The parameter estimates (total sugar consumption)

表6 方差分析(總糖消耗)Table 6 The analysis of variance (total sugar consumption)

由圖4可知，6 h之后糖消耗速率增大，說明菌體代謝旺盛，乙醇生成量也大量增加，并且總糖實測值幾乎都在擬合曲線附近且屬于95%置信區(qū)間之內。由表5和表6可知，此模型相關系數(shù)為0.9975，均方根誤差為5.4，F(xiàn)值為2882.53，說明此方程擬合效果好，能較好反映260 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過程中總糖消耗的過程變化。

綜上，將經(jīng)過軟件模擬的3個方程的動力學參數(shù)整合并帶入到各自方程中得到動力學方程，見表7。

表7 擬合方程及各自相關系數(shù)Table 7 The fitting equations and respective correlation coefficients

2.3 模型數(shù)值比較

將各自模型的試驗值和理論值進行比較，并用相對誤差表示結果的可信度，見表8。

表8 模型試驗值和理論值的比較Table 8 Comparison of model experimental values and theoretical values

續(xù) 表

由表8可知，除了發(fā)酵初期的乙醇試驗值與擬合值差距較大外，其余試驗值與擬合值相對誤差絕大多數(shù)在10%以內，所以在此條件下，釀酒酵母GJ2008發(fā)酵高濃度蔗糖產(chǎn)乙醇的過程能夠用以上發(fā)酵動力學模型來表示。

3 結論與展望

就本研究而言，酵母菌發(fā)酵0～6 h處于快速生長期的前期，總糖消耗緩慢，酒精生成比較緩慢；發(fā)酵6～15 h是酵母菌快速生長期的中后期，菌體活力高，耗糖能力和產(chǎn)乙醇能力增加；在15 h之后，菌體進入穩(wěn)定期，數(shù)量趨于平緩，耗糖能力和產(chǎn)乙醇能力依然很高，說明在高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵過程中，乙醇不僅在酵母快速生長期的中后期大量生成，穩(wěn)定期也有相當一部分乙醇生成，33 h之后乙醇量趨于平緩，最大乙醇量為111.17 g/L。

利用Logistic方程和Luedeking-Piret-like方程建立高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵過程中酵母生長、乙醇生成和總糖消耗的動力學模型，通過Origin 9.5軟件對方程進行非線性回歸及相關系數(shù)分析，得到方程預測值與試驗值的數(shù)據(jù)相關系數(shù)R2分別為0.9929，0.9940，0.9975，具有很高的擬合度，表明模型能夠較好地說明蔗糖乙醇發(fā)酵過程中酵母生長、乙醇生成和總糖消耗的動力學特性。為了更清楚地找到高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵過程中菌體生長、乙醇生成和總糖消耗的規(guī)律，我們在后續(xù)會增加不同濃度蔗糖乙醇發(fā)酵試驗，并對產(chǎn)物生成動力學方程進行優(yōu)化，通過對不同濃度下擬合的結果進行分析，找到最適合高濃度蔗糖條件下乙醇發(fā)酵的動力學方程，對甘蔗汁和甘蔗糖蜜的擴大生產(chǎn)有一定的參考意義。