基于生物信息學(xué)方法的人類GLTP在胰腺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制分析

馬梅燕，冀慎英，張湘豫，盧夢云，鄒先瓊

（1. 桂林醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，桂林 541004； 2. 桂林醫(yī)學(xué)院 a. 生物技術(shù)學(xué)院；b. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，桂林 541100）

人類糖脂轉(zhuǎn)運蛋白（glycolipid transfer protein，GLTP）的空間結(jié)構(gòu)是由α-螺旋組成的特別的兩層“三明治”狀結(jié)構(gòu)，這種“三明治”狀結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是真核生物GLTP蛋白家族的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及原型蛋白［1］。GLTP位于人類12號染色體（基因座12q24.11）上，編碼一個可溶的約24 kD的糖脂轉(zhuǎn)運蛋白，介導(dǎo)糖鞘脂（glycosphingolipid，GSL）膜間轉(zhuǎn)運并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)GSL的穩(wěn)態(tài)水平［2］。GLTP被認(rèn)為在葡萄糖神經(jīng)酰胺代謝中發(fā)揮作用，其過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)葡萄糖神經(jīng)酰胺的合成和轉(zhuǎn)移顯著增加［3］。然而，決定特定糖鞘脂蛋白選擇性的機(jī)制以及GLTP如何結(jié)合到目的膜和最終釋放到受體膜的過程仍不清楚［4-5］。特異性蛋白1（specificity protein 1，Sp1）及特異性蛋白3（specificity protein 3，Sp3）能調(diào)控GLTP的表達(dá)，而神經(jīng)酰胺處理改變了Sp1及Sp3與GLTP啟動子結(jié)合的親和性，降低了Sp3的乙?；剑?］。迄今為止，人類GLTP在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的研究尚未見于文獻(xiàn)。

表觀遺傳調(diào)控涉及DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNA（miRNA）的作用等，與炎癥、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和自身免疫疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，哺乳動物的DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷（cytosine-guanine dinucleotide，CpG）中［7］。在組蛋白修飾中，組蛋白H3K4Me1的分布可預(yù)測轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)和啟動子的激活，在與關(guān)鍵染色質(zhì)調(diào)控因子的結(jié)合中起重要作用［8-9］。組蛋白H3K4Me3存在于真核生物基因組啟動子區(qū)域，通常被認(rèn)為是一種激活的調(diào)控方式，可介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄激活，在基因轉(zhuǎn)錄中具有指示作用［10］。在人紅白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞中，MYB的啟動子區(qū)域有激活型的組蛋白H3K27Ac、H3K4Me1的修飾，血紅素誘導(dǎo)分化后，這些表觀修飾的富集度降低［11］。組蛋白H3K27Ac常位于基因的增強(qiáng)子中，在基因轉(zhuǎn)錄中為激活狀態(tài)［12］。其在食管癌放射抵抗細(xì)胞中高表達(dá)，且富集于OIP5-AS1的啟動子區(qū)域［13］。miRNA是內(nèi)源性合成的約22～25個核苷酸的小的非編碼RNA分子，能通過控制靶mRNA的穩(wěn)定性和翻譯參與調(diào)控關(guān)鍵的生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化和血管生成等［14］。

本研究的目的在于通過生物信息學(xué)分析研究人類GLTP在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步深入闡明人類GLTP的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 人類GLTP序列的獲得

利用美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索人類GLTP，獲得其基因序列號、核酸序列號以及蛋白序列號，并進(jìn)一步的分析。

1.2 腫瘤組織中的表達(dá)及生存分析

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）分析人類GLTP在胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）腫瘤組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)情況［15］，并從GEPIA數(shù)據(jù)庫的子程序“stage plot”中下載PAAD患者的GLTP表達(dá)水平的病理分期圖，從而分析GLTP表達(dá)水平與PAAD患者病理分期的關(guān)系。

1.3 甲基化對GLTP的作用

通過在線服務(wù)器cBioportal（https://www.cbioportal.org/）分析人類GLTP在PAAD組織中的甲基化與基因表達(dá)的相關(guān)性［16］。通過Wanderer在線服務(wù)器（http://maplab.imppc.org/wanderer/）分析PAAD組織及癌旁正常組織人類GLTP甲基化程度的差異［17］。

1.4 組蛋白修飾對GLTP的作用

通過在線服務(wù)器UCSC Genome Browser（http://www.genome.ucsc.edu/）分析組蛋白修飾對GLTP的調(diào)控作用［18］。

1.5 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過miRcode在線分析工具（http://mircode.org/）預(yù)測可能調(diào)控人類GLTP的miRNA種類［19］，并利用DIANA Tools數(shù)據(jù)庫（http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/page&view=software）的子程序MirPath v.3及HMDD數(shù)據(jù)庫（http://www.cuilab.cn/hmdd?Tdsourcetag=s_pcq q_aiomsg）對這些潛在的miRNA影響的信號通路及經(jīng)過試驗驗證的相關(guān)疾病進(jìn)行分析。通過DIANA Tools數(shù)據(jù)庫的子程序LncBase v.2進(jìn)一步分析得到經(jīng)過試驗驗證的、與這些潛在作用的miRNA有相互作用且得分較高的lncRNA（閾值為0.539）［20］。通過Cytoscape 3.8.0軟件繪制人類GLTP內(nèi)源競爭RNA（ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 人類GLTP序列的獲得

利用美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI檢索人類GLTP，獲得其基因序列號為NC_000012.1，核酸序列號為NM_016433.4，蛋白序列號為NP_057517.1。

2.2 腫瘤組織中的表達(dá)及生存分析

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析人類GLTP在多種腫瘤組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，人類GLTP在PAAD組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，差異顯著（P＜0.05）（圖1a）。這提示GLTP可能參與了PAAD的發(fā)生發(fā)展。

對GLTP表達(dá)水平與PAAD患者病理分期的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，GLTP表達(dá)水平在PAAD患者不同病理分期中的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05），單因素方差分析得出F值為1.36，其對應(yīng)P值為0.256（圖1b）。

圖1 人類GLTP在PAAD發(fā)生發(fā)展中的作用分析Fig. 1 Analysis of role of human GLTP in initiation and progression of PAAD（a）人類GLTP在PAAD組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)（該圖通過GEPIA數(shù)據(jù)庫在線分析獲得。圖中紅色箱點圖表示人類GLTP在PAAD組織中的表達(dá)水平，灰色箱點圖表示人類GLTP在癌旁正常組織中的表達(dá)水平，*P＜0.05。T：腫瘤組織；N：癌旁正常組織）；（b）人類GLTP表達(dá)水平與PAAD患者病理分期圖（由GEPIA數(shù)據(jù)庫中“stage plot”分析獲得）。(a) Expression of human GLTP in PAAD tissues and its adjacent normal tissues (The figure was obtained through online analysis of GEPIA database. The red box dot plot shows the expression level of human GLTP in PAAD tissues, and the gray box dot plot shows the expression level of human GLTP in adjacent normal tissues. *P＜0.05. T: Tumor tissues; N: Adjacent normal tissues); (b) Human GLTP expression level and pathological staging in PAAD patients (Obtained by “stage plot” analysis in GEPIA database).

2.3 甲基化對人類GLTP的調(diào)控作用

通過在線服務(wù)器cBioportal對人類GLTP在PAAD組織中的甲基化與基因關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在178個PAAD病人樣本中Spearman（P=1.439e-4）和Pearson（P=7.002e-4）相關(guān)系數(shù)的P值均小于0.05（圖2a），表明在PAAD細(xì)胞中，人類GLTP的甲基化與其表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性。Wanderer在線服務(wù)器分析結(jié)果也表明，人類GLTP上游大約500 bp范圍內(nèi)至少有兩個CpG位點在PAAD組織及癌旁正常組織甲基化程度存在顯著差異（圖2b）。

圖2 人類GLTP甲基化與PAAD的相關(guān)性分析Fig. 2 Correlation analysis of methylation of human GLTP and PAAD（a）PAAD組織中人類GLTP甲基化與基因表達(dá)的相關(guān)性分析；（b）PAAD及癌旁組織中人類GLTP甲基化程度的比較分析。箭頭顯示 GLTP的位置及轉(zhuǎn)錄方向。CNA: 拷貝數(shù)畸變。(a) Correlation analysis of methylation of human GLTP and gene expression in PAAD tissues; (b) Comparative analysis of GLTP methylation in pancreatic cancer and adjacent tissues. The arrow shows position and transcription direction of human GLTP. CNA: Copy number alterations.

2.4 組蛋白修飾對GLTP的作用

通過在線服務(wù)器UCSC Genome Browser分析組蛋白修飾對GLTP的作用，結(jié)果表明：在K562細(xì)胞中，組蛋白H3K4Me1在GLTP的第一外顯子上下游結(jié)合水平顯著上升，提示組蛋白H3K4Me1可通過上調(diào)GLTP的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程；組蛋白H3K4Me3在K562細(xì)胞內(nèi)和H1-hsc細(xì)胞中的結(jié)合水平相似；在K562細(xì)胞中組蛋白H3K27Ac在第一外顯子上下游中的結(jié)合水平顯著上升，這提示組蛋白H3K27Ac可通過上調(diào)GLTP的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程（圖3）。

圖3 組蛋白H3K4Me1、H3K4Me3及H3K27Ac對人類GLTP的調(diào)控作用分析Fig. 3 Histone H3K4Me1, H3K4Me3 and H3K27Ac analysis of human GLTP regulation effect（a）人類GLTP的結(jié)構(gòu)；（b）人類GLTP在對應(yīng)區(qū)域與組蛋白H3K4Me1、組蛋白H3K4Me3、組蛋白H3K27Ac的結(jié)合程度。 (a) Genomic structure of human GLTP; (b) The binding degree of human GLTP to histone H3K4Me1, histone H3K4Me3 and histone H3K27Ac in the corresponding region.

2.5 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過miRcode在線分析工具預(yù)測可能調(diào)控人類GLTP的miRNA種類，結(jié)果表明，靈長類保守性為56%及以上的miRNA主要包括hsa-miR-27a-3p、hsamiR-125a-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-129-5p、hsamiR-372-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-141-3p、hsamiR-125a-3p、hsa-miR-138-5p等（表1）。

表1 通過miRcode分析調(diào)控人類GLTP表達(dá)的miRNATab. 1 miRNA analysis for regulating human GLTP expression through miRcode

利用DIANA Tools數(shù)據(jù)庫的子程序MirPath v.3及HMDD數(shù)據(jù)庫對這些潛在miRNA影響的信號通路及經(jīng)過試驗驗證的相關(guān)疾病進(jìn)行分析，結(jié)果表明，這些與人類GLTP潛在作用的miRNA與多種腫瘤及信號通路存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。MirPath v3.0及HMDD檢索表明：hsa-miR-27a表達(dá)上調(diào)抑制乳腺癌、肝癌、胰腺癌等的發(fā)生發(fā)展［22］；hsa-miR-125a表達(dá)上調(diào)促進(jìn)心力衰竭、狼瘡性腎炎、肌萎縮，而抑制黑色素瘤、白血病等的發(fā)生發(fā)展［23］；hsa-miR-129表達(dá)上調(diào)抑制前列腺癌的發(fā)生發(fā)展［24］；hsa-miR-125b表達(dá)上調(diào)促進(jìn)前列腺癌、阿爾茨海默病、乙型肝炎病毒感染、口腔鱗狀細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤等的發(fā)生發(fā)展［25］；hsa-miR-372表達(dá)上調(diào)促進(jìn)睪丸腫瘤、小腦癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等的發(fā)生發(fā)展［26］；hsamiR-141表達(dá)上調(diào)抑制腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，其在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)［27］；hsa-miR-138表達(dá)上調(diào)促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展，而抑制膽囊癌、心血管疾病、腎細(xì)胞癌等的發(fā)生發(fā)展［28］。

圖4 人類GLTP的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 4 ceRNA regulatory network of human GLTP將miRcode預(yù)測得到的miRNA以及DIANA Tools-LncBase v.2分析得到的lncRNA輸入Cytoscape軟件進(jìn)行構(gòu)建獲得人類GLTP的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。淺藍(lán)色矩形表示lncRNA，藍(lán)紫色V形表示miRNA，紅色棱形表示GLTP。The ceRNA regulatory network of human GLTP was constructed by inputting the miRNA predicted by miRcode and the lncRNA analyzed by DIANA Tools-lncBase V. 2 into Cytoscape software. The light blue rectangle represents lncRNA, the blue-purple V-shape represents miRNA, and the red prismatic represents GLTP.

3 討論

胰腺癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其特點是惡性程度高、發(fā)現(xiàn)較晚且進(jìn)展迅速，其主要的病理類型為PAAD［29］。在腫瘤組織中的表達(dá)及生存分析結(jié)果中，人類GLTP在PAAD組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，提示GLTP很可能參與了PAAD的發(fā)生發(fā)展。值得注意的是，GLTP表達(dá)水平與PAAD臨床分期差異不顯著，這提示PAAD的發(fā)生發(fā)展可能受到包括GLTP在內(nèi)的多種基因的影響，同時還很有可能受其他拮抗因子的影響，但具體原因還有待研究并加以驗證。

甲基化分析結(jié)果表明，在PAAD細(xì)胞中，人類GLTP的甲基化程度與其表達(dá)水平呈顯著的負(fù)相關(guān)性。而相對于癌旁組織，人類GLTP在PAAD細(xì)胞中呈高表達(dá)。這些結(jié)果提示，在PAAD細(xì)胞中，人類GLTP低度的甲基化可能上調(diào)了GLTP的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮了促進(jìn)PAAD發(fā)生發(fā)展的作用。組蛋白修飾的分析結(jié)果表明，組蛋白H3K4Me1和組蛋白H3K27Ac很有可能通過上調(diào)人類GLTP的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA通過靶向參與細(xì)胞增殖、生存、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因起到抑癌基因或癌基因的作用［30］。將人類GLTP在線分析數(shù)據(jù)直接輸入到Cytoscape這個可視化的通用平臺，生成圖形化的網(wǎng)絡(luò)圖，直觀地展示出了人類GLTP的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的miRNA、lncRNA的功能及其在疾病中的關(guān)系提示了人類GLTP的相關(guān)研究方向。

本研究利用了近幾年發(fā)展的生物信息學(xué)在線網(wǎng)絡(luò)分析工具，證明了人類GLTP在PAAD發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要的作用，并揭示了其可能的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為深入研究人類GLTP在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制提供了參考。