納米銀／石墨烯凝膠的制備及其殺菌性能

馮義平， 張伊健， 陳 廣， 吳靜怡， 連興業

（廣東工業大學環境科學與工程學院，廣州510006）

0 引 言

環境科學與工程專業旨在培養解決環境污染問題的科研及應用型人才［1-2］。因此，在系統學習基礎理論課程和開展基礎實驗的同時，針對實際環境問題，組織實施創新探索型實驗尤為重要。開展創新實驗不僅有助于學生深刻理解專業理論知識，還大大提升學生解決實際環境問題的綜合實踐和自主創新能力［3-4］。

新型冠狀病毒肺炎（CO-VID-19）疫情的爆發重新引發了人們對生產、生活環境殺菌消毒的重視。因此，開發新型高效殺菌消毒技術也成為科學前沿問題。石墨烯作為一種新型二維碳納米材料，優越的物理化學性質使其在水處理技術開發領域具有巨大的潛力。以石墨烯為基體制備的石墨烯基凝膠具有高比表面積、優秀的機械性能、耐酸堿等優點，還具備易回收的優點，因此在水處理領域具有廣闊的應用前景［5-7］。納米銀（silver nanoparticles，AgNPs）具有高效廣譜、不易產生耐藥性、安全性高等優點，已成為當前抗菌材料的研究熱點［8-9］。納米銀的殺菌機制通常包括損傷DNA、中斷細胞信號轉導、活性氧自由基的氧化損傷、細胞膜結構破壞內容物泄漏、脫氫酶失活等［9］。然而，應用納米銀顆粒作為殺菌劑存在易流失、回收難的缺陷，這極大限制了納米銀在實際水處理中的應用。

本文通過水熱還原一步法制備了納米銀／石墨烯復合凝膠，解決了納米銀的流失和回收難題。對復合凝膠的微觀結構進行了表征，并對復合凝膠的殺菌性能進行了測試。該該實驗將學科基礎知識與創新性研究有機結合，實驗內容具有綜合性、應用性和新穎性的特點，對于培養學生的創新、綜合實踐能力很有幫助。

1 試劑與儀器

試劑：天然鱗片狀石墨（50目）購自青島富雷克石墨新材料有限公司，硝酸銀（AgNO3）、硫酸（H2SO4）、磷酸（H3PO4）、鹽酸（HCl）、高錳酸鉀（KMnO4）、雙氧水（H2O2）等分析純試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗所用大腸桿菌（E.coli，ATCC 25 922）購買于上海魯微科技有限公司；所用培養基成分胰蛋白胨（LP0042）和酵母提取物（LP0021）均購買于賽默飛世爾科技公司；瓊脂（BR）均購買于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為去離子水或電阻系數不小于18.2 MΩ·cm的超純水。

儀器：磁力攪拌器，水熱反應釜（100 mL容量的聚四氟乙烯內襯管），烘箱，離心機，燒杯，高壓滅菌鍋，真空冷凍干燥機，X射線光電子能譜儀（XPS），掃描電子顯微鏡（SEM），紫外-可見分光光度計。

2 實驗內容

2.1 氧化石墨烯的制備

以鱗片狀石墨為前驅體，利用改進的Hummers法制備氧化石墨烯（GO）［10-11］。制備在通風櫥中進行：首先在500 mL燒杯中分別加入20 mL濃H3PO4和180 mL濃H2SO4，配制體積比為9∶1的混合濃酸，燒杯置于磁力攪拌水浴鍋，持續攪拌，控制溫度約50℃。加入1.5 g石墨鱗片攪拌均勻后，緩慢加入9.0 g高錳酸鉀（用時約40 min）。控制溫度為50℃，持續攪拌6.0 h。加入30% H2O2直至燒杯中溶液顏色由黑色變為金黃色，并繼續攪拌3 h。緩慢加入超純水稀釋降溫，在10 000 r／min離心5 min后，棄去上清液得到下層固體。用10%鹽酸清洗下層固體，離心分離后再次洗滌3次，后用去離子水反復洗滌3次，收集固體于去離子水中透析直至透析液呈中性，將最終獲得的GO冷凍干燥備用。

2.2 納米銀／石墨烯凝膠的制備

納米銀／石墨烯凝膠（AgNPs／GH）的制備過程如圖1所示［12］。首先取GO分散于超純水中，通過超聲分散制備濃度為2 mg／mL的GO懸浮液。取20 mL上述制備的GO懸浮液置于100 mL燒杯中，加入1 mmol／L的AgNO3超聲5 min混合均勻后轉移至水熱反應釜內，在180℃下保持12 h，冷卻后將制得的水凝膠樣品在去離子水中浸泡24 h去除未反應的離子，得到AgNPs／GH。通過改變AgNO3的加入量，在相同制備條件下獲得銀負載量／質量分數分別為0%、1%、2%、5%、10%、20%的AgNPs／GH樣品。

圖1 納米銀／石墨烯凝膠的合成過程示意圖

2.3 AgNPs／GH的表征

采用德國Zeiss Sigma300（鏡頭Gemini）掃描電子顯微鏡（SEM）對凝膠的微觀形貌進行表征。取AgNPs／GH水凝膠切成片狀，于真空冷凍干燥機中干燥24 h制得待測樣，噴金后在10 kV加速電壓下觀察其表面形態。使用X射線光電子能譜檢測凝膠的元素組成。儀器型號為Thermo Scientific K-Alpha＋，X射線源為單色化AlKa源（Mono AlKa），能量為1 486.6 eV，電壓為15 kV。

2.4 AgNPs／GH的殺菌性能測試

選擇大腸桿菌作為模型細菌考察納米銀／石墨烯水凝膠的殺菌性能［13］。將大腸桿菌（E.coli）在50 mL Luria-Bertani（LB）營養液中、37℃下振蕩孵育4 h后，將細菌的培養液于4 000 r／min離心15 min，并用生理鹽水離心洗滌3次后，將大腸桿菌重懸浮于生理鹽水中。取一定量大腸桿菌溶液用生理鹽水進行稀釋，制得含有105CFU／mL的細菌細胞的懸浮液。各取20 mL細菌懸浮液加入100 mL錐形瓶，并依次加入不同銀負載量（質量分數）的，AgNPs／GH（0%～20%），同時設置不加凝膠的組作為對照，每個處理包括3個平行。將所有處理組置于恒溫水浴振蕩培養器于25℃，150 r／min振蕩培養。在給定的取樣時間（0、1、2、5、8、10 min），分別從錐形瓶中取50 μL溶液用生理鹽水進行稀釋，并于營養瓊脂平板上涂布，在37℃培養24 h。最后通過計數形成的菌落數確定AgNPs／GH的殺菌效率。同時，取AgNPs／GH-10凝膠進行填柱子，考察在動態過濾系統中納米銀／石墨烯凝膠對實際自然水體的殺菌效率。取80 mg凝膠塞入omint玻璃柱，并組裝成動態過濾系統，通過蠕動泵控制流速為2 mL／min，如圖2所示。根據填柱凝膠的體積和流速計算估計過濾系統中細菌懸浮液在AgNPs／GH中的保留時間約為2 min。每隔一定時間取50 μL流出液，同樣方法進行涂布培養計數活菌數。

圖2 以納米銀／石墨烯凝膠為濾芯的柱過濾系統示意圖

3 實驗結果與討論

3.1 AgNPs／GH的形貌分析表征

圖3（a）為制備的GH和AgNPs／GH水凝膠的照片。水凝膠呈圓柱形，經水熱還原后GO中的O元素大大減少，因此GH和AgNPs／GH均呈現黑色［14-15］；而AgNPs／GH由于納米銀的摻雜引入，表面可見明顯的灰白色。GH和AgNPs／GH均具有較好的機械強度。將GH和AgNPs／GH水凝膠冷凍干燥后進行掃描電子顯微鏡（SEM）表征，如圖3（b）所示。高分散的GO經水熱還原自組裝后，石墨烯納米片隨機扭曲交聯形成了多孔海綿狀結構的GH［16-17］。摻雜納米銀后，AgNPs／GH內部的微觀結構并沒有顯著變化，依然是多孔的三維海綿結構，但納米銀的覆蓋導致石墨烯的邊緣尖銳度降低。同時，通過SEM的Mapping模式對AgNPs／GH中Ag元素的分布進行了觀察，圖3（c）顯示Ag元素是以點球狀均勻分布在凝膠上，也說明了Ag是以納米銀球負載在GH上［13］。此外，通過X射線光電子能譜（XPS）對GH和AgNPs／GH水凝膠的元素組成進行分析。如圖3（d）所示，GH凝膠主要由C、O元素組成，而AgNPs／GH中則主要含C、O、Ag 3種元素。同時，Ag3d含兩個峰，分別為368.41 eV和374.39 eV處的Ag3d5／2和Ag3d3／2的特征峰，這表明銀元素以單質銀的形態存在。結合SEM圖譜進一步證實銀元素以納米銀的形式摻雜到石墨烯凝膠上。

圖3 AgNPs／GH的形貌分析表征

3.2 AgNPs／GH的殺菌性能

采用大腸桿菌（E.coli）考察了不同納米銀負載量的AgNPs／GH的殺菌性能。將E.coli和納米銀負載量為1%～20%的AgNPs／GH共孵育一段時間（1、5、10、30、60 min）后，進行涂布計數，統計殺菌效率，不摻雜納米銀的石墨烯凝膠作為對照。圖4顯示單純的GH對E.coli的殺菌效率極低，在接觸60 min后，殺菌率僅為3%；而摻雜納米銀后殺菌效率大大提高，且AgNPs／GH對E.coli的殺菌效率隨著納米銀含量的升高而增大。如，經60 min的暴露，當納米銀含量從1%增加到20%后，AgNPs／GH對E.coli的殺菌效率從54%升高到100%；當納米銀的含量為5%時，殺菌效率可達97%以上，這表明AgNPs／GH對E.coli的殺菌性能主要是納米銀的負載造成的。同時，還考察了AgNPs／GH對E.coli經不同處理時間后的殺菌效率，結果表明殺菌效率隨著處理時間的延長而增大。如納米銀含量為5%時，隨著接觸時間從1 min延長到60 min，AgNPs／GH對E.coli的殺菌效率由57%升高到97%。

圖4 不同納米銀負載量下AgNPs／GH對大腸桿菌的殺菌效果

此外，采用動態柱過濾裝置考察了以AgNPs／GH為濾芯的凈水裝置對大腸桿菌的連續殺菌效果。圖5表明不同體積的大腸桿菌溶液（初始濃度為105CFU mL－1）經AgNPs／GH-10水凝膠過濾后的殺菌效率。結果表明，當處理溶液體積不超過360 mL時，殺菌效率可達100%；當處理溶液體積增加到540 mL時，殺菌效率降低到95%；當處理溶液體積增加到720 mL時，殺菌效率仍達84%以上，但此時由于柱堵塞導致柱壓力大大升高，因此沒有再繼續進行考察。特別地，經計算可知，在柱系統中大腸桿菌與AgNPs／GH接觸2 min后即可失活，遠比細菌懸浮液與AgNPs／GH接觸孵育相同時間的殺菌效率高。這可能是因為在接觸孵育中E.coli僅與三維AgNPs／GH的外表面接觸，而在過濾裝置中E.coli可同時與內部孔道和外表面接觸導致的。

圖5 不同體積的大腸桿菌懸浮液通過AgNPs／GH過濾裝置后大腸桿菌的殺菌率

3.3 AgNPs／GH對實際水體的殺菌性能

采用AgNPs／GH過濾裝置對廣州市內一些實際水體（珠江（S1）、大學城中心湖（S2）、廣東工業大學校內湖（S3）、南沙十九涌內河（S4））進行了殺菌處理。采取的實際水樣經過普通濾紙過濾除去大顆粒物后，將不同的水樣分別通過AgNPs／GH柱過濾裝置進行過濾，同樣控制流速為2 mL／min。取過濾殺菌之后的水和未殺菌的原水在培養基上進行涂布、培養、計數，統計得出殺菌效率。如圖6所示，AgNPs／GH過濾裝置能有效殺死實際水體中的大部分細菌，殺菌率達到95%以上。

圖6 AgNPs／GH凝膠過濾裝置對實際水體的殺菌效果

4 結 語

該實驗設計以簡單一步水熱還原法制備納米銀／石墨烯復合凝膠，采用SEM、XPS對復合凝膠的形貌性質、微觀結構進行了表征。通過大腸桿菌對復合凝膠的殺菌性能進行了測試，并對實際水體的殺菌進行了探索。該實驗制備方法簡單，容易操作，還涉及環境化學、儀器分析、材料化學、微生物等知識，知識面覆蓋較廣，適合作為學生的探索創新實驗。該實驗從當今環境熱點問題切入，融合科學研究前沿和基礎理論設計了該創新實驗。對于拓寬學生的科學視野，提高學生的綜合實踐能力以及理論聯系實際能力大有幫助。